研究背景
中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）無論是急性（例如創(chuàng)傷性損傷）還是慢性（例如神經(jīng)退行性疾?。┑膿p傷，都會導致不可逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)元損害甚至死亡，而那些存活下來的神經(jīng)元有的能長出新的軸突并重新建立突觸連接。該研究通過單細胞轉(zhuǎn)錄組揭示了與視神經(jīng)擠壓 （ONC）后小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（RGC）的選擇性恢復能力相關(guān)的差異表達程序。
實驗方法
材料：成年小鼠（n=10）眼球中分離的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（RGC）
方法：單細胞轉(zhuǎn)錄組測序、免疫組化、FISH、轉(zhuǎn)錄組測序
研究結(jié)果
1、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（RGC）類型分析
通過熒光分選（FACS）從成年（產(chǎn)后56天）小鼠眼、球中分離出RGC，進行scRNA-seq分析（圖 1A），共獲得35,699個細胞，分為45個cluster（圖 1C），45個cluster的相對豐度從0.15%到8.4%不等（圖 1D）。45個cluster都表達泛RGC標記，例如Slc17a6、Rbpms和Pou4中的至少一個（圖 1E），45個cluster top2差異基因（DE）如圖1F所示。
圖1 scRNA-seq揭示成年小鼠45種不同的RGC類型
2、結(jié)合scRNA-seq和形態(tài)學共同定義RGC類型
利用FISH和IHC技術(shù)對視網(wǎng)膜中RGC進行標記和定位，發(fā)現(xiàn)不同的視網(wǎng)膜層具有不同的視網(wǎng)膜細胞，例如特異性表達Gpr88和Fam19a4的C10和C24在內(nèi)叢狀層（IPL）的S2和S4中，而表達Slc17a7的C25僅在S5中（圖 2A）。
通過scRNA-seq和形態(tài)學對視網(wǎng)膜進行雙重驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)aRGC為C41-43、45這4個cluster（圖 2B）；之前的研究僅確定了4個T-RGC和4個F-RGC類型，但單細胞揭示了每個亞類中的第5種類型（分別為C9和C32；圖 2C和2D）；同時ipRGC也發(fā)現(xiàn)了M1（C33和40）、M2（C31）和 M4（C43）類型的標記（圖 2E）；ooDSGC中大部分是Cartpt+，通過Mmp17的表達確定了N-ooDSGC；C16表達的Col25a1，是D-和V-ooDSGC的marker。最后CALB1+細胞是D-ooDSGCs ，CALB2高表達細胞是V-ooDSGC（圖 2F-2H）。已知RGC子類與cluster存在部分重合，每種cluster不超過兩個子類。子類與cluster重合表達的基因如圖2J，如：4/5 T-RGCs （Tbr1+）、4/5 F-RGCs （Foxp2+）、5/9 T5-RGCs （Tusc5+）、4/5 ipRGCs（Opn4+）和3/4 aRGC（Spp1+）。另外還鑒定到了新的子類：如8個表達轉(zhuǎn)錄因子Neurod2和Satb2的cluster被化為N-RGC等。其余11/45類型未分配到子類，但它們確實表現(xiàn)出與其他類型的相關(guān)性。
圖2 scRNA-seq簇與RGC形態(tài)學類型的對應(yīng)關(guān)系
3、不同RGC類型對ONC的敏感性差異很大
以RGC圖譜為基礎(chǔ)，評估了不同細胞類型對ONC的彈性（圖 3A）。在ONC后14天對~8,500個RGC進行分析，此時~80% RGC已經(jīng)死亡（圖 3C），該研究使用iGraphBoost對細胞進行分群（圖 3B），iGraphBoost可以將89%損傷的RGC分配到各個cluster中（圖 3C）。損傷后第14天所有cluster表達的marker基因同1F（圖3D）。與對照相比，將14dpc不同RGC類型的存活率按從高到低排列（圖 3E），不同RGC類型在14dpc時表現(xiàn)出不同的存活率，范圍從1%到98%不等。比較轉(zhuǎn)錄組測序和IHC對細胞活率的結(jié)果，結(jié)果高度一致（Pearson r = 0.97）（圖 3H）。這些數(shù)據(jù)表明不同RGC對傷害的不同反應(yīng)。所有ipRGC（Opn4+）都是有彈性的，所有N-RGC類型都是易受影響的（圖 3F）。之前被定性為彈性子類的aRGC中，C42，43具有很高的彈性，但C41，45相對容易受到影響（圖 3F）。同樣，稀有和豐富的類型都可能具有彈性或脆弱性（圖 3G）。因此，基因表達或RGC子類都不是判斷細胞是否是彈性的完美因子。
圖3 損傷后RGC的scRNA-seq分析
4、損傷后RGC的存活率定義了三個生存組
在ONC后的前3天內(nèi)，很少有RGC死亡，在接下來的5天內(nèi)死亡約70%，28dpc時逐漸下降到約10%（圖 3I）。根據(jù)它們的損失動力學，將RGC類型分為三組：7個cluster是有彈性的類型，在14dpc時達到約50%的存活率；11個cluster是“中間”類型，在4到7dpc之間表現(xiàn)出顯著下降；27個cluster是脆弱類型，4dpc時顯著減少（圖 3J-3M）。因此，中間和脆弱RGC（分別為intRGC和susRGC）的存活率在4dpc時顯著不同（susRGC：39%±21%；intRGC：95%±25%）。
5、ONC后的基因表達譜
為了研究RGC中激活損傷反應(yīng)，對ONC后的RGC進行基因表達譜分析，確定了771個在不同類型之間的DE基因，通過k均值聚類（圖 4A）劃分為8個模塊（Mod1-8），識別具有不同時間動態(tài)的基因集，這些基因集富集在不同的GO功能中，例如在0.5dpc開始下降的模塊1（Mod1）中的基因富集在健康神經(jīng)元相關(guān)的GO功能中，如動作電位、突觸囊泡胞外/內(nèi)吞作用和逆行軸突運輸（圖 4B）。相比之下，在Mod5和Mod6中的基因與細胞凋亡和應(yīng)激途徑相關(guān)（圖 4C）。DE基因幾乎沒有表現(xiàn)出強烈的類型特異性差異，但ipRGC類型除外，Mod5、6和7中C22、C31、C33和C40中的基因的上調(diào)明顯低于其他類型（圖 4D和4E）。
圖4 scRNA-seq揭示促進RGC神經(jīng)保護的衍生候選物
6、單細胞技術(shù)確定與神經(jīng)保護相關(guān)的基因
尿皮質(zhì)素（Ucn），它編碼來自促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子家族的肽；促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素結(jié)合蛋白（Crhbp）。ONC后Ucn僅在aRGC中上調(diào)，而Crhbp在ONC前后susRGC中表達（圖 5A和5B）。過表達Ucn，注射Ucn重組蛋白，通過CRISPR和兩種不同的sgRNA敲除Crhbp，結(jié)果發(fā)現(xiàn)四種方式都顯著增加RGC的存活率（圖 5C和5J）。隨后又驗證了幾對基因的表達和功能富集情況，結(jié)果與Ucn和Crhbp類似。說明可以通過對基因的干預來保護部分脆弱的RGC類型。
圖5 影響RGC生存的基因
總結(jié)
該研究分析發(fā)現(xiàn)不同類型的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（RGC）對軸突損傷的耐受性不同，一些基因可改善視神經(jīng)擠壓（ONC）后神經(jīng)元存活和軸突再生。這項研究提供了分析損傷類型特異性反應(yīng)的實例，并證明了差異基因表達可用于揭示干預的分子靶標，本文方法還可用于鑒定新的神經(jīng)保護機制。
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