百邁客單細胞和空間轉錄組測序
單細胞轉錄組測序（scRNA）是在單細胞水平進行高通量基因表達譜檢測，對復雜細胞群深入分析，表征單個細胞的表達譜，避免單個細胞的異質性生物學信息被大量細胞的均質化覆蓋。
空間轉錄組（ST）是以高空間分辨率解析RNA-seq數(shù)據(jù)的技術，實現(xiàn)解析單個組織切片中的所有mRNA，從而能夠定位和區(qū)分功能基因在特定組織區(qū)域內的活躍表達信息，對于癌癥、免疫、腫瘤免疫相互作用，組織微環(huán)境，神經(jīng)和發(fā)育等領域，有著令人期待的應用前景。
單細胞和空間轉錄組技術原理對比：
導讀
肝轉移是結直腸癌死亡的主要原因，其免疫微環(huán)境（TME）表現(xiàn)出高度異質性。本研究使用單細胞RNA-seq和空間轉錄組學對97個配對的樣本進行測序。發(fā)現(xiàn)轉移灶免疫微環(huán)境經(jīng)歷了免疫抑制細胞（如MRC1+ CCL18+ M2樣巨噬細胞）的空間重編程，并發(fā)現(xiàn)巨噬細胞具有較強的代謝活性。同時，新輔助化療可以阻斷這種狀態(tài)并恢復患者的抗腫瘤免疫平衡。本研究解析了結直腸癌肝轉移的免疫細胞進化軌跡，并揭示了腫瘤對新輔助化療的不同反應。
實驗方法
材料：癌及癌旁組織樣本
（1）人組織樣本：20名患者（未治療患者n = 11；PD/SD患者n = 5；PR患者n = 4）的89個組織樣本進行了scRNA-seq；4名患者（未治療患者n = 2；PR患者n = 2）的組織ST測序；27名患者的104個樣本進行mIHC分析（未治療的CRC和癌旁組織n = 17；未治療的LM和癌旁組織n = 18；已治療的PR CRC和癌旁組織n = 9；已治療的PR LM和癌旁組織n = 8）
（2）小鼠組織樣本：4只小鼠發(fā)生肝轉移，1只小鼠發(fā)生結直腸腹膜轉移：原發(fā)性腫瘤（n = 4）和轉移性腫瘤（n = 5）進行scRNA測序
方法：單細胞轉錄組測序、空間轉錄組測序、mIHC
研究結果
1、單細胞和空間轉錄組學繪制可切除CRLM中的免疫細胞多樣性
為了獲得CRLM的單細胞圖譜，本研究應用scRNA-seq和ST來量化CD45+細胞的動力學（圖 1A），使用結直腸癌（CRC）組織及癌旁、肝轉移（LM）組織及癌旁，沿結腸的淋巴結（LN）組織和外周血單核細胞（PBMC）。根據(jù)嚴格的篩選標準，共招募24 名可切除的CRLM患者。最終共計20名患者的89份樣本進行了scRNA-seq，4名患者的8份樣本進行了ST測序，其中包括未接受治療的13名患者的54份樣本，新輔助化療后PR的6名患者的30份樣本，新輔助化療后PD或SD的5名患者的13份樣本（圖 1A）。所有腫瘤均為微衛(wèi)星穩(wěn)定。
來自未治療患者（n = 11）的79,703個細胞、來自NAC PD/SD患者（n = 5）的36,284 個細胞和來自NAC PR患者的62,643個細胞（n = 4）用于進一步分析。每個樣本平均包含2,007個細胞，每個細胞中1,064個基因（中位數(shù)），在不同樣本之間沒有明顯的批次效應。整合所有178,630個CD45+細胞，進行了聚類分析，并使用SingleR和細胞marker基因注釋主要細胞類型。與之前的結腸癌scRNA-seq基本一致，本研究從CRLM樣本中鑒定到了骨髓細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、NK細胞和B細胞（圖 1B、1C）。值得注意的是，不同組織類型的T細胞比例明顯不同，表明免疫微環(huán)境的組織異質性（圖 1D）。CRC和配對LM樣本中所有CD45+細胞中Treg細胞約占10%，而這些細胞在相鄰的正常組織中很少見，這表明腫瘤內免疫受到抑制，這之前被歸因于肝轉移中免疫治療效果降低。同樣，本研究整合了SingleR和基于marker基因的手動注釋，進一步注釋了免疫細胞亞群（圖 1E）。
本研究分析了來自2名未治療患者和2名NAC PR患者的8個樣本（配對的CRC和 LM）的ST數(shù)據(jù)（圖 1F、1G）。無監(jiān)督聚類分析將樣品分為不同的區(qū)域，例如腫瘤細胞和成纖維細胞區(qū)域（圖 1F）。為了整合scRNA-seq和ST數(shù)據(jù)，本研究使用Seurat來量化主要免疫細胞亞群。在未經(jīng)處理的樣本中，觀察到與scRNA-seq一致的免疫細胞模式，例如CD8+T細胞在LM和CRC中的顯著富集（圖 1G）。相比之下，在NAC處理的樣本中，觀察到較小的腫瘤區(qū)域和免疫細胞的不規(guī)則分布，特別是在LM中，只有一小部分spot聚集在癌細胞中，表明NAC治療后細胞區(qū)室的重塑。總之，結果突出了CRLM患者的免疫細胞時空圖譜和NAC后免疫細胞的重塑。CRLM單細胞圖譜現(xiàn)已在線提供，用于探索原發(fā)和轉移部位的免疫多樣性（http://www.cancerdiversity.asia/scCRLM）。
圖1 scRNA-seq和空間轉錄組學揭示CRLM的免疫細胞圖譜
2、轉移性腫瘤的巨噬細胞可能轉向抑制狀態(tài)
本研究進行了基于配體-受體的癌癥-免疫串擾分析，并在原發(fā)部位和轉移部位之間進行比較（圖 2A），發(fā)現(xiàn)SPP1+巨噬細胞和MRC1+ CCL18+巨噬細胞在LM和CRC之間的差異較大，這一結果表明肝轉移癌細胞可能優(yōu)先重編程巨噬細胞并誘導其特定的功能狀態(tài)（圖 2A）。值得注意的是，LM中的轉移性腫瘤細胞優(yōu)先表達配體CD47，這是一個重要的檢查點，因此可能招募相應的受體SIRPA或激活MRC1+ CCL18+巨噬細胞（圖 2B）。進一步利用mIHC來可視化這些蛋白質，觀察CD47+腫瘤細胞和SIRPA+巨噬細胞之間的串擾（圖 2C）。這些配體-受體對為靶向治療肝轉移提供了線索。
對CRC和LM巨噬細胞進行了差異基因表達分析，結果發(fā)現(xiàn)LM的MRC1+ CCL18+巨噬細胞高度表達了對巨噬細胞極化至關重要的廣譜關鍵分子（圖 2D）。APOE作為抗炎和pro-M2轉化蛋白，是顯著差異表達的基因之一，其他M2極化相關基因如MARCO在LM的MRC1+ CCL18+巨噬細胞中也顯著上調（圖 2E）。相比之下，CRC的MRC1+ CCL18+巨噬細胞表現(xiàn)出更高的炎性細胞因子表達，包括TNF、IL1B、CCL3和CCL4。在SPP1+巨噬細胞中也觀察到這種基因表達譜的變化，表明巨噬細胞具有從原發(fā)部位到轉移部位的共同功能變化。通路富集分析顯示（圖 2F）CRC和LM的MRC1+ CCL18+巨噬細胞在代謝通路中高度富集，證明這些巨噬細胞在代謝功能中的基本作用。值得注意的是，CRC中的MRC1+ CCL18+巨噬細胞富含氧化磷酸化，而它們在LM中則以氨基酸代謝為主。這些數(shù)據(jù)證明，代謝調節(jié)可能介導巨噬細胞響應不同的免疫微環(huán)境。
圖2 轉移性腫瘤中MRC1+ CCL18+巨噬細胞表現(xiàn)出終末分化和抑制狀態(tài)
3、MRC1+ CCL18+巨噬細胞在肝轉移中的代謝活性急劇增加
為了解CRLM中髓樣細胞的代謝情況，首先計算了抑制性巨噬細胞和單核細胞中76種活躍代謝途徑的得分，選擇了前50%的可變代謝評分，并根據(jù)其平均代謝評分對骨髓細胞（不包括低豐度的骨髓細胞）進行了排名（圖 3B），發(fā)現(xiàn)LM浸潤的MRC1+ CCL18+巨噬細胞在所有骨髓細胞中表現(xiàn)出最高的代謝活動，這可能與它們在轉移部位的獨特功能有關。通過對MRC1+ CCL18+巨噬細胞的所有代謝相關基因的進一步無監(jiān)督聚類，發(fā)現(xiàn)其與周圍組織較強的代謝偏好（圖 3C），確定了CRC和LM免疫浸潤的MRC1+CCL18+巨噬細胞中可能上調的42種代謝途徑。其中，苯丙氨酸代謝有助于產(chǎn)生酪氨酸，在LM的MRC1+ CCL18+巨噬細胞中表達更高。隨后研究了差異表達的代謝基因，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性和轉移性MRC1+ CCL18+巨噬細胞中特異性上調的代謝基因，部分是已知藥物的靶基因（圖 3C）。GSTO1是細胞色素P450代謝的一種酶，在CRC和LM浸潤的MRC1+CCL18+巨噬細胞中顯著升高，并與分化相關（圖 3D 和 3E）。巨噬細胞激活所必需的基因IL4I1和MIF也顯示出相似的特征（圖 3D 和 3E）。mIHC驗證這些代謝酶，觀察到基本一致的結果（圖 3F）。
接下來構建CRLM的小鼠模型（圖 3G）并將scRNA-seq應用于原發(fā)性/轉移性腫瘤。結果在小鼠CRLM模型中發(fā)現(xiàn)了類似的巨噬細胞亞群，例如Mrc1+巨噬細胞和Spp1+巨噬細胞（圖 3H）。沒有觀察到這些巨噬細胞在原發(fā)部位和轉移部位之間的顯著差異比例，可能是由于原發(fā)腫瘤是在皮下而不是在結腸中建立的。進一步的代謝分析顯示了LM和CRC浸潤巨噬細胞的特征代謝狀態(tài)（圖 3I）。檢查了前3條差異表達途徑（小鼠模型中的LM與CRC），其中一些在人和小鼠中是保守的。例如，氧化磷酸化和苯丙氨酸代謝在人和小鼠巨噬細胞之間是一致的。苯丙氨酸代謝的關鍵酶Mif的表達也與人CRLM一致。總之，LM中的巨噬細胞代謝活性急劇增加，例如苯丙氨酸代謝。抑制這種代謝活動可能會調動抗腫瘤免疫反應來控制晚期CRC的肝轉移。
為了說明代謝重編程與巨噬細胞表型變化的關聯(lián)，本研究計算了巨噬細胞的經(jīng)典通路評分，例如抗原加工、呈遞、炎癥、血管生成、免疫抑制、吞噬作用、白細胞介素信號通路和補體評分（圖 3J）。在LM中，MRC1+ CCL18+巨噬細胞的抗原加工和呈遞以及補體活性評分顯著增加（圖 3J），SPP1+巨噬細胞也顯示出類似的趨勢。某些基因如HLA-A（MHC I類分子之一）在LM的MRC1+ CCL18+巨噬細胞中上調。進一步分析了42種腫瘤高代謝途徑與MRC1+ CCL18+巨噬細胞通路評分之間的相關性，發(fā)現(xiàn)包括戊糖和葡萄糖醛酸互變在內的幾種巨噬細胞特異性代謝途徑與LM中的抗原加工和呈遞有很強的相關性，但在CRC的相關性很弱（圖 3K）。這些數(shù)據(jù)表明不同的代謝功能在MRC1+ CCL18+巨噬細胞表型中的潛在作用。
圖3 轉移性腫瘤中的MRC1+ CCL18+巨噬細胞顯示出高代謝活性
4、NAC反應性和非反應性腫瘤具有不同的免疫動力學
為探索NAC對腫瘤免疫的影響，本研究使用TooManyCells對所有CD45+細胞進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)CRC和LM之間細胞聚類的顯著差異（圖 4A）。NAC對TME的影響高度依賴于細胞類型（圖 4B和4C）。通常，在PR中，NAC可以下調免疫抑制細胞并激活細胞毒性細胞（圖 4B）。在LM中，響應性NAC下調SPP1+巨噬細胞但上調細胞毒性T細胞，例如GZMK+CD8+ T細胞和XCL1+CD8+ T細胞（圖 4B和4D）。NAC-PR中僅剩下幾個MRC1+ CCL18+巨噬細胞和幾十個SPP1+巨噬細胞，表明NAC在抑制巨噬細胞中的潛在作用。然而，在PD/SD中，觀察到與PR不同的免疫細胞變化。例如，SPP1+巨噬細胞和MRC1+ CCL18+巨噬細胞在LM中增加，而細胞毒性免疫細胞（即FGFBP2+ GZMB+ CD8+ T細胞）下調（圖 4C、4E和4F）。這些結果可能與癌細胞的器官特異性和治療效果有關。例如，轉移性PD/SD癌細胞表現(xiàn)出DNA修復和脂肪酸代謝的特異性富集，而轉移性PR癌細胞與脂肪生成更相關。除腫瘤組織外，NAC上調鄰近正常肝臟中GZMB+CD8+ T細胞的比例，并增加PR患者PBMC中FGFBP2+GZMB+CD8+ T細胞的比例。對于PD/SD患者，在鄰近結腸和肝臟中也觀察到FGFBP2+ GZMB+CD8+ T細胞水平降低?？傊?，有效的NAC不僅重新編程了腫瘤內免疫平衡，還激活了全身抗腫瘤免疫反應，為支持NAC在可切除CRLM中的潛在作用提供了證據(jù)。
圖4 新輔助化療通過激活細胞毒性免疫細胞和抑制轉移性腫瘤中的免疫抑制細胞來恢復免疫平衡
結論
本研究展示了CRLM的空間和細胞圖譜，并確定了新輔助化療對TME的功能影響，加深了我們對CRLM免疫生物學的理解。本研究對發(fā)生轉移時激活的代謝途徑進行了深入分析，為癌癥轉移生物學研究提供獨特的見解。
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