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英文題目：Collagen β(1-O) galactosyltransferase 2 deficiency contributes to
lipodystrophy and aggravates NAFLD related to HMW adiponectin in mice
中文題目：Colgalt2缺乏可導(dǎo)致小鼠脂質(zhì)營養(yǎng)不良，加重與HMW脂聯(lián)素相關(guān)的NAFLD
發(fā)表雜志：Metabolism
影響因子：6.159
發(fā)表時間：2021年4月15日
合作單位：首都醫(yī)科大學(xué)
非酒精性脂肪肝(NAFLD) 是世界范圍內(nèi)最普遍的慢性肝病，影響了近25%的全球人口。根據(jù)組織學(xué)特征，NAFLD可分為非酒精性脂肪肝(NAFL)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。隨著NAFLD的進(jìn)展，近20%的NAFLD患者可能會出現(xiàn)NASH，而部分NAFLD患者(4% NAFL和20% NASH)可能在其一生中發(fā)展為肝硬化。目前，NAFLD的有效治療仍然有限，重要原因之一是其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。
研究概要總結(jié)
目的
課題組前期研究結(jié)果顯示，Colgalt1基因敲除導(dǎo)致小鼠E11.5天胚胎死亡，及抑制膠原分泌。本研究旨在闡明膠原β(1-O)半乳糖轉(zhuǎn)移酶2(Colgalt2)在非酒精性脂肪肝(NAFLD)發(fā)病機(jī)制中的作用。
方法
采用高脂飼料(HFD)或缺乏蛋氨酸-膽堿的飼料(MCD)喂養(yǎng)Colgalt2?/?小鼠。利用ONT全長轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對肝臟組織進(jìn)行測序。進(jìn)一步，在體外誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性和前脂肪細(xì)胞分化。
結(jié)果
在6周齡時，Colgalt2?/?小鼠體重增加，肝臟脂肪堆積。在HFD或正常飲食的小鼠中，Colgalt2敲除加重肝脂肪變性。Colgalt2敲除促進(jìn)MCD喂養(yǎng)小鼠的NASH。在HFD小鼠中，Colgalt2敲除導(dǎo)致脂肪萎縮，并降低血漿HMW（高分子量）、總脂聯(lián)素和瘦素水平。在HFD喂養(yǎng)的小鼠中，Colgalt2敲除也降低了血液中HMW/總脂聯(lián)素，而脂聯(lián)素的mRNA和蛋白質(zhì)水平在WT和Colgalt2?/?小鼠中沒有差異。ONT全長轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果顯示脂聯(lián)素受體下游信號通路和脂肪生成基因的轉(zhuǎn)錄變化，包括AMPK信號通路、脂肪細(xì)胞因子信號通路和脂質(zhì)代謝(Cidea、Cidec、CD36和PPARγ)。Colgalt2敲除對油酸OA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞或原代肝細(xì)胞的脂質(zhì)堆積與對照組細(xì)胞無顯著差異。然而，干擾Colgalt2可抑制脂肪細(xì)胞生成，并降低PPARγ(脂肪生成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子)在前脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)。
結(jié)論
在小鼠中，Colgalt2敲除導(dǎo)致脂肪萎縮加重與HMW脂聯(lián)素相關(guān)的NAFLD。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計
構(gòu)建Colgalt2?/? （C57BL/ 6J背景）小鼠。
高脂肪飲食模式
8周齡雄性Colgalt2+/+（WT）和Colgalt2?/? 小鼠，隨機(jī)分為正常飲食組Chow（N=10）或高脂飲食組HFD（N=12）16周。每周測量體重（BW）。造模結(jié)束后，犧牲小鼠。對肝臟和附睪白色脂肪組織（eWAT）進(jìn)行稱重并收集以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。血漿儲存于?80°C.
蛋氨酸和膽堿缺乏飲食模型
7周齡雄性WT和Colgalt2?/? 小鼠維持蛋氨酸膽堿充足飲食MCS（N=6）或蛋氨酸膽堿缺乏飲食MCD（N=8），持續(xù)3周。造模結(jié)束后，犧牲小鼠，稱取體重和肝重。采集血漿和肝臟樣本作進(jìn)一步分析實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)技術(shù)： 葡萄糖耐量(GTT)和胰島素耐量(ITT)檢測，血漿生化分析及肝甘油三酯含量測定，H&E染色，油紅O染色及免疫組化染色，ONT全長轉(zhuǎn)錄組測序（ONT全長轉(zhuǎn)錄組測序由百邁客協(xié)助完成），WB和qRT-RCR驗(yàn)證。
測序平臺：Nanopore
Colgalt2缺乏機(jī)制原理圖
文章結(jié)果
1、Colgalt2基因敲除小鼠中體重和肝臟脂質(zhì)積累增加
通過肝組織的PCR和western blotting，結(jié)果顯示Colgalt2?/?小鼠中不表達(dá)COLGALT2。在3,6,8周齡時分別對Colgalt2?/?和WT小鼠稱重，結(jié)果顯示Colgalt2敲除增加了小鼠的體重(圖1a)。通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，6周齡Colgalt2?/?小鼠肝細(xì)胞中有脂滴聚集(圖1b)。然而，在6-8 周齡時，WT小鼠和Colgalt2?/?小鼠的肝油紅O染色和TG含量沒有明顯差異(圖1c)。
圖1 Colgalt2丟失增加了體重和肝臟脂質(zhì)積累
2、在HFD喂養(yǎng)的小鼠中發(fā)現(xiàn)Colgalt2敲除增加肝臟脂肪變性和胰島素抵抗
為了研究Colgalt2敲除對HFD誘導(dǎo)的NAFLD的影響，雄性WT和Colgalt2?/?小鼠分別飼喂HFD或正常飼料16周。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Colgalt2?/?小鼠的體重增加大于HFD組的WT小鼠(圖2a)。此外，與WT小鼠相比，HFD喂養(yǎng)的Colgalt2?/?小鼠的肝臟TG含量增加了54%，標(biāo)準(zhǔn)飼料組的Colgalt2?/?小鼠的肝臟TG含量增加了60%(圖2c)。同時，在HFD或標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)的小鼠中，肝切片的H&E和油紅O染色顯示，Colgalt2?/?小鼠的肝脂肪變性比WT小鼠更嚴(yán)重(圖2f)。
血液ALT和AST水平表明HFD喂養(yǎng)的Colgalt2?/?小鼠的肝損傷加重。HFD喂養(yǎng)的Colgalt2?/?小鼠血漿中ALT和AST水平分別比WT小鼠高2倍和1.2倍(圖2b)。然而，HFD喂養(yǎng)的Colgalt2?/?小鼠和WT小鼠的血漿TG、TC和HDL水平?jīng)]有顯著差異(圖2e)。此外，空腹血糖(FBG)、GTT和ITT表明HFD小鼠的胰島素敏感性受損(圖2c)。在HFD喂養(yǎng)的小鼠中，與WT小鼠相比Colgalt2?/?小鼠的FBG水平在11周后增加了13%(圖2c)。GTT和ITT檢測發(fā)現(xiàn)HFD小鼠的循環(huán)葡萄糖水平高于正常飼料喂養(yǎng)的小鼠，且在Colgalt2敲除小鼠中也明顯增加(圖2c)。
圖2. HFD喂養(yǎng)的Colgalt2?/?小鼠增強(qiáng)肝臟脂肪變性和胰島素抵抗
3、Colgalt2敲除增加MCD誘導(dǎo)的脂肪性肝炎
NASH是NAFLD疾病進(jìn)展階段。為了研究 Colgalt2對MCD誘導(dǎo)的脂肪性肝炎的影響，WT和Colgalt2?/?小鼠連續(xù)喂食MCD飲食3周。與WT小鼠相比，Colgalt2?/?小鼠的體重和肝臟重量增加(圖3a和b)。在MCD喂養(yǎng)的小鼠中，Colgalt2?/?小鼠的ALT和AST血漿水平及AST均顯著升高(圖3 c)。H&E和油紅O染色顯示，MCD喂養(yǎng)的Colgalt2?/?小鼠的肝臟脂肪變性和炎癥浸潤比WT小鼠更嚴(yán)重(圖3e)。與此同時，與WT小鼠相比，MCD喂養(yǎng)的Colgalt2?/?小鼠肝臟TG含量顯著增加(圖3d)。在MCD飲食組中，Colgalt2?/?小鼠的炎癥評分明顯高于WT小鼠(圖3e)。
圖3. Colgalt2缺乏加重MCD誘導(dǎo)的小鼠肝脂肪變性和脂肪性肝炎
4、Colgalt2敲除導(dǎo)致脂肪萎縮，降低小鼠血漿HMW脂聯(lián)素和瘦素水平
脂聯(lián)素對肝細(xì)胞有重要的抗脂肪變性作用。因此，為了檢測Colgalt2對脂聯(lián)素的影響，作者研究了脂聯(lián)素在白色脂肪組織WAT中的表達(dá)、血漿總脂聯(lián)素和HMW脂聯(lián)素水平。出人意料的是，在Colgalt2缺陷的小鼠中觀察到部分脂肪營養(yǎng)不良。與WT小鼠相比，Colgalt2?/?小鼠(6周齡)的eWAT體重降低(圖4b)。此外，在HFD喂養(yǎng)16周后，Colgalt2敲除抑制小鼠的脂肪組織擴(kuò)張，而在WT小鼠脂肪組織明顯體積增大(圖4b)。脂肪形成由復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)(C/EBP家族成員，PPARγ，SREBP-1c等) 控制，這些因子在脂聯(lián)素基因表達(dá)、代謝和其他脂肪特異性基因中發(fā)揮重要作用。在HFD喂養(yǎng)的Colgalt2?/?小鼠中，C/EBPα、C/EBPβ和脂肪生成標(biāo)記物SREBP1a有降低趨勢(圖4d)。此外，在HFD喂養(yǎng)的Colgalt2?/?小鼠中，p-SREBP-1c和n-SREBP- 1c蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(圖4e)。
接下來，作者檢測了Colgalt2是否與脂聯(lián)素的表達(dá)和HMW脂聯(lián)素的血漿水平有關(guān)。HFD喂養(yǎng)16周后，WT小鼠eWAT組織中COLGALT2表達(dá)降低(圖4d)。在eWAT中，HFD喂養(yǎng)的小鼠與喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料的小鼠相比，脂聯(lián)素蛋白表達(dá)降低(圖4e)。然而，HFD喂養(yǎng)的Colgalt2?/?小鼠和WT小鼠的eWAT組織中脂聯(lián)素mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)沒有顯著差異(圖4d和e)。同時結(jié)果顯示，喂養(yǎng)正常飼料的Colgalt2?/?小鼠和WT小鼠的循環(huán)總脂聯(lián)素沒有顯著差異(圖4f)。為了明確脂肪組織中脂聯(lián)素的分泌，分析了脂聯(lián)素水平與eWAT質(zhì)量的關(guān)系。結(jié)果顯示Colgalt2缺失降低了HFD小鼠血漿總脂聯(lián)素和HMW脂聯(lián)素的水平(圖4f)。此外，與標(biāo)準(zhǔn)飼料小鼠相比，飼喂HFD 16周的WT和Colgalt2?/?小鼠血漿中總脂聯(lián)素或HMW脂聯(lián)素水平與eWAT體重相關(guān)(圖4f)。WAT分泌的脂聯(lián)素和瘦素是介導(dǎo)糖脂代謝的脂肪因子;因此，測量了飼喂HFD的WT和Colgalt2?/?小鼠的血漿瘦素水平。結(jié)果顯示，Colgalt2缺乏降低了小鼠高脂飲食喂養(yǎng)16周的血漿瘦蛋白水平。
圖4 Colgalt2敲除導(dǎo)致小鼠脂肪萎縮，降低血漿HMW 脂聯(lián)素和瘦蛋白水平
5、利用ONT全長轉(zhuǎn)錄組技術(shù)揭示脂聯(lián)素/脂聯(lián)素受體信號通路和脂肪生成基因機(jī)制
為了探索NAFLD中Colgalt2缺乏的潛在機(jī)制，作者對WT小鼠和飼喂HFD或標(biāo)準(zhǔn)飼料的Colgalt2?/?小鼠肝組織進(jìn)行ONT全長轉(zhuǎn)錄組測序。結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，HFD喂養(yǎng)的Colgalt2?/?小鼠中有321個DEGs。為了明確DEGs的功能，分別對上調(diào)和下調(diào)的 DEGs進(jìn)行KEGG通路富集分析(P < 0.05) (圖5a)。對于上調(diào)的基因，KEGG分析顯示這些差異表達(dá)基因顯著富集于MAPK信號通路、NAFLD、和氧化磷酸化。下調(diào)的基因富集于脂肪消化和吸收、甘油脂代謝。在這些途徑中，19個差異表達(dá)基因與脂代謝密切相關(guān)，包括adipoR1、adipoR2和脂質(zhì)合成相關(guān)的分子，包括Cidea和Cidec (FSP27)、Cd36和PPARγ(圖5c)。為了進(jìn)一步研究這19個基因在這些通路中的作用，使用ClueGO和CluePedia工具解讀這些通路網(wǎng)絡(luò)(圖5 d)。這些基因在AMPK信號通路、脂肪細(xì)胞因子信號通路和NAFLD等中富集（圖5 b和e)。
與WT小鼠相比，HFD喂養(yǎng)的Colgalt2?/?小鼠的肝臟中AdipoR2 mRNA和蛋白表達(dá)水平分別下降到約70%和65%(圖5f)。然而，與WT小鼠相比，標(biāo)準(zhǔn)飼料組肝臟的adipoR1 mRNA和蛋白表達(dá)水平低于HFD組的Colgalt2?/?小鼠(圖5f)。接下來，研究了adipoR與AMPKα和PPARα信號通路相關(guān)的下游分子在肝臟中的變化。與WT小鼠相比，HFD喂養(yǎng)Colgalt2?/?小鼠肝臟中AMPKα激活和AMPKα磷酸化顯著降低(圖5f)。AMPKα通過ACC磷酸化抑制脂肪生成。與WT小鼠相比，HFD喂養(yǎng)的Colgalt2?/?小鼠肝臟中ACC的磷酸化顯著降低(圖5f)。在HFD喂養(yǎng)的Colgalt2?/?小鼠中PPARα的表達(dá)高于WT小鼠(圖6f)。對肝臟組織的ONT全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析也顯示，在Colgalt2?/?小鼠中脂肪生成基因表達(dá)上調(diào)。與HFD喂養(yǎng)的WT小鼠相比，HFD喂養(yǎng)的Colgalt2?/?小鼠的肝臟顯示PPARγ、CD36、Cidea、FSP27α和FSP27β mRNA水平增加(圖5f)。與WT小鼠相比，HFD喂養(yǎng)的Colgalt2?/?小鼠肝臟中脂質(zhì)代謝相關(guān)的分子的蛋白水平均上調(diào)，包括PPARγ、CD36和Cidea(圖5f)。
圖5. WT和Colgalt2?/?小鼠肝臟組織ONT全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果
6、Colgalt2敲除下調(diào)脂肪形成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)
接下來，研究了Colgalt2是否會調(diào)控體外肝細(xì)胞中的脂質(zhì)積累。在干擾COLGALT2的hepG2細(xì)胞和對照細(xì)胞中，用500 μM OA處理24 h后，COLGALT2降低，而rh-脂聯(lián)素(500 ng/ml)處理顯著提高了OA處理下COLGALT2的表達(dá)(圖6a)。然而，干擾COLGALT2的hepG2細(xì)胞與對照組細(xì)胞在OA處理24 h后，TG含量沒有顯著差異(圖6b)。
為了探究COLGALT2缺乏在脂肪萎縮中的作用， 在3T3-L1細(xì)胞中誘導(dǎo)了前脂肪細(xì)胞分化，從Colgalt2?/?和WT小鼠的eWAT中分離原代前脂肪細(xì)胞(圖6d)。油紅 O染色結(jié)果顯示干擾Colgalt2降低了前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞(圖6e)。此外，干擾Colgalt2下調(diào)了脂肪前細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化過程中PPARγ的表達(dá)(圖6e)。此外，從Colgalt2?/?和WT小鼠的eWAT中分離出原代前脂肪細(xì)胞，結(jié)果顯示，Colgalt2敲除降低了PPARγ mRNA水平(圖6d)。然而，來自Colgalt2?/?和WT小鼠的原代前脂肪細(xì)胞分化后，C/EBPα、C/EBPβ或SREBP-1c mRNA水平無顯著差異。
圖6 Colgalt2缺乏抑制前脂肪細(xì)胞分化和脂肪形成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)
總結(jié)
在本研究中，首次證實(shí)了Colgalt2缺乏抑制脂肪生成并導(dǎo)致脂肪萎縮減少脂聯(lián)素分泌加重NAFLD。在體外，Colgalt2缺乏不直接影響肝細(xì)胞中TG的積累，但抑制脂肪細(xì)胞形成，減少脂肪分化過程中與脂肪形成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子PPARγ的表達(dá)。Colgalt2缺乏降低血漿HMW和總脂聯(lián)素水平，從而調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，這與脂聯(lián)素受體及其下游AMPKα/ACC信號通路有關(guān)。這些數(shù)據(jù)可能為NAFLD發(fā)病機(jī)制提供了一個新的見解的思路。
文獻(xiàn)下載：
https://international.biocloud.net/zh/article/detail/33865898
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