百邁客全轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)品優(yōu)勢
百邁客全轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)是一次檢測，獲得四種分子（mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA）信息，針對不同類型的RNA進行表達分析，結(jié)構(gòu)研究以及全新轉(zhuǎn)錄本的發(fā)現(xiàn)，并結(jié)合競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）機制，進行聯(lián)合分析，深入挖掘轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，深度探究各類RNA分子的調(diào)控機制。分析內(nèi)容如下：
導讀
circRNA在多種生理過程中發(fā)揮著重要作用，因此許多疾病與circRNA有關(guān)，特別是癌癥。前期已有大量研究發(fā)現(xiàn)肝細胞癌（HCC）中circRNA表達普遍下調(diào)，pre-mRNA 3′ 末端復合物參與circRNA環(huán)化并在 HCC 腫瘤發(fā)生中起重要作用。因此，本研究探索了CPSF4在circRNA 3′ 末端形成和剪切中的作用。臨床研究表明，CPSF4在HCC中表達上調(diào)，CPSF4的高表達與HCC患者的不良預后相關(guān)。機制研究表明，CPSF4導致具有多聚腺苷酸化信號序列的circRNA降低，這類circRNA的減少導致miRNA的降低并破壞了HCC中miRNA介導的基因沉默。細胞培養(yǎng)和異種移植小鼠模型的實驗表明，CPSF4促進HCC細胞的增殖并增強致瘤性。綜上，在HCC中CPSF4通過抑制circRNA和破壞miRNA介導的基因沉默引發(fā)癌癥。
實驗方法
材料：5位術(shù)前未經(jīng)治療的HCC患者癌組織和癌旁組織樣本；TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)
方法：轉(zhuǎn)錄組測序、circRNA測序、細胞遷移實驗、生存分析
研究結(jié)果
1、circRNAs在HCC組織中下調(diào)
為了探索HCC中的circRNA表達譜，本研究分析了幾個公開可用的數(shù)據(jù)，包括GSE94508、GSE97332和GSE14520，結(jié)果顯示在3個GEO數(shù)據(jù)庫中，HCC的circRNA表達水平下降。盡管通過選擇性剪接和多聚腺苷酸化導致廣泛的RNA縮短是癌癥中的常見現(xiàn)象，但circRNA的長度分布沒有改變，并且所有長度的circRNA表達水平都下降。PAS序列是多聚腺苷酸化剪切的核心元件，分析表明HCC組織中的circRNA無論是否含有PAS序列均顯著下調(diào)。然而，在3個GEO數(shù)據(jù)庫中，含有PAS的circRNA的平均水平顯著低于不含PAS的circRNA，這表明PAS介導的剪切在circRNA形成中起重要作用。綜上所述，HCC組織中circRNAs整體減少，PAS介導的RNA裂解可能是導致circRNA下調(diào)的原因之一。
2、CPSF4高表達與HCC患者的不良預后相關(guān)
由于CPSF4表達在HCC中顯著增加，并且其高水平表達對應于HCC中OS的最高風險，因此本研究將重點放在CPSF4上。通過比較50對配對的序列數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)HCC腫瘤組織中CPSF4表達水平顯著高于正常鄰近組織。來自GSE49515的微陣列數(shù)據(jù)還表明，10名HCC患者的外周血單核細胞（PBMC）樣本中的CPSF4水平顯著高于10名健康對照，這表明CPSF4可以作為HCC診斷的生物標志物（圖 1A）。Kaplan-Meier對364例患者的生存分析顯示，5 年生存率從 CPSF4低表達患者的57%±5%下降到CPSF4高表達患者的42%±5%（p < 0.01，圖 1B）。進一步的相關(guān)分析表明，CPSF4與臨床TNM分期、病理分級和臨床分期顯著相關(guān)（圖 1C）。單變量分析表明HCC患者的OS率與高CPSF4表達之間存在關(guān)聯(lián)（p < 0.01）。多變量Cox回歸分析顯示CPSF4水平（p = 0.03）是OS的獨立預后因素（圖 1D）。
通過對臨床標本的分析進一步驗證了生物信息學結(jié)果。本次檢測的5個樣本中，CPSF4的蛋白質(zhì)印跡顯示，與癌旁組織相比，HCC癌組織中表達更高（圖 1E）。此外，細胞系中CPSF4的蛋白水平也顯示CPSF4在所有HCC細胞系（Hep3B、Bel7402、Huh7、HepG2和Bel7404）中均高表達，但在正常肝細胞L02中幾乎檢測不到（圖 1F）。在5個HCC細胞系中，HepG2的CPSF4表達水平最高，而Bel7402的水平最低。在Bel7402和HepG2細胞中構(gòu)建了CPSF4敲低和過表達細胞，但由于Bel7402中的CPSF4表達非常低，所以無法檢測到Bel7402-KD細胞中的敲低效率；雖然HepG2中的CPSF4表達非常高，但在HepG2-OE細胞中的過表達效率也非常低。因此，大部分CPSF4 KD實驗是在HepG2細胞中完成的，而大部分CPSF4 OE實驗是在Bel7402細胞中完成的。由41對組織樣本組成的人類HCC組織微陣列的免疫組化（IHC）染色結(jié)果也證實了HCC組織中CPSF4的上調(diào)。在41個患者中，25個HCC組織表現(xiàn)出CPSF4高表達。相比之下，大多數(shù)癌旁組織顯示出弱或中等的CPSF4表達（圖 1G）。相關(guān)性分析還表明，CPSF4表達與臨床TNM分期、病理分級和臨床分期顯著相關(guān)（圖 1H）。
圖1 CPSF4在HCC組織中高表達，并提示HCC患者預后不良
3、CPSF4降低HCC細胞中circRNA的表達水平
由于CPSF4負責PAS剪切，因此本研究假設(shè)CPSF4的增加加速了circRNA的降解并降低了它們在HCC細胞中的水平。為了驗證這一假設(shè)，提取CPSF4-KD HepG2細胞、CPSF4-OE Bel7402細胞及其陰性對照的總RNA，并通過高通量測序進行分析。結(jié)果顯示，在CPSF4-OE細胞中檢測到下調(diào)circRNA（1058）多于上調(diào)circRNA（821），并且circRNA的平均表達水平顯著降低。相比之下，CPSF4-KD細胞中大多數(shù)circRNA（5005個circRNA中的3221個）上調(diào)，circRNA的平均表達水平顯著增加（圖2A，B）。通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，CPSF4主要抑制外顯子circRNA，只有一小部分circRNA是內(nèi)含子或內(nèi)含子-外顯子circRNA。CPSF4-OE細胞和CPSF4-KD細胞中circRNA的長度分布均未改變（圖 2C），但CPSF4調(diào)節(jié)后的circRNA變化依賴于PAS。首先，在4種細胞系中，含有PAS的circRNA的表達顯著低于不含PAS的circRNA；其次，CPSF4-KD細胞含有PAS序列的circRNA明顯上調(diào)，但在沒有PAS序列的circRNA中沒有檢測到變化（圖 2D）。而在CPSF4-OE細胞中帶有或不帶有PAS序列的circRNA都減少了，推測在高表達水平CPSF4的存在下，除了6個傳統(tǒng)PAS序列之外的一些非特異性PAS序列也可以被剪接。
為了驗證，本研究首先從GEO數(shù)據(jù)庫中選擇了HCC組織中807個下調(diào)的circRNA（FC>2，p<0.05）；然后從RNA-seq數(shù)據(jù)中篩選了1447個在CPSF4-OE細胞中下調(diào)或在CPSF4-KD細胞中上調(diào)的circRNA。這兩組數(shù)據(jù)取交集，共得到24個circRNA作為驗證的候選circRNA；結(jié)構(gòu)分析表明其中16個含有PAS序列。實時PCR結(jié)果顯示，這16個circRNA中有13個在CPSF4-OE細胞中被抑制，但在CPSF4-KD細胞中被激活（圖 2E）。選擇2個帶有PAS元件的circRNA，hsa_circ_0027774 和 hsa_circ_0004913 作為CPSF4靶向的circRNA；同時，另一個廣泛研究的不含PAS元件的circRNA hsa_circ_0001946作為CPSF4非靶向circRNA。Northern blot結(jié)果表明hsa_circ_0027774和hsa_circ_0004913與CPSF4呈負相關(guān)，但hsa_circ_0001946在所有細胞系中保持相同水平（圖 2F）。同時構(gòu)建了這三種circRNA的OE質(zhì)粒并與CPSF4 OE或KD質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，real-time PCR結(jié)果顯示帶有PAS的circRNA（hsa_circ_0027774和hsa_circ_0004913）與CPSF4水平呈負相關(guān)，而不含PAS的circRNA（hsa_circ_0027774和hsa_circ_0004913）不受CPSF4的影響（圖 2G），這說明CPSF4在轉(zhuǎn)錄后抑制了circRNA?？傊珻PSF4直接調(diào)節(jié)HCC細胞中帶有PAS元件的circRNA的表達。
圖2 CPSF4可減少HCC細胞中的circRNA生物合成
4、CPSF4介導的circRNA減少可以導致miRNA的減少并破壞miRNA介導的基因沉默
為了測試CPSF4介導的circRNA減少是否會影響miRNA的穩(wěn)定性，從CPSF4-OE和CPSF-KD細胞中提取總miRNA，結(jié)果顯示CPSF4-OE細胞中miRNA（4-40 nt）和tRNA（40-80 nt）的比率降低，但在CPSF4-KD細胞中增加（圖 3A-C），這證實了CPSF4能夠減少miRNA的積累。
與其他癌癥一樣，HCC中的miRNA表達水平整體下降。大多數(shù)下調(diào)的miRNA與本研究之前篩選的807個下調(diào)的circRNA互補。選擇與hsa_circ_0004913部分互補的hsa-miR-383-5p、hsa-miR-142-5p，以及與hsa_circ_0027774部分互補的hsa-miR-450b-3p和hsa-miR-145-5p作后續(xù)分析。實時PCR顯示4種miRNA在CPSF4-KD細胞中均增加，而在CPSF4-OE細胞中減少（圖 3D）。HepG2細胞中的circRNA探針證實hsa-miR-145、hsa-miR-450b與hsa_circ_0027774結(jié)合，而hsa-miR-142、hsa-miR-383與hsa_circ_0004913結(jié)合。AGO2免疫沉淀（RIP）結(jié)果顯示hsa_circ_0004913、hsa_circ_0027774及其結(jié)合的miRNA在AGO2抗體相關(guān)復合物中特異性富集，但在對照IgG中沒有富集。在CPSF4-KD細胞中，與對照相比hsa_circ_0004913/has-miR-383和hsa_circ_0027774/hsa-miR-145對增加；但在CPSF4-OE細胞中減少，這表明CPSF4介導的circRNA減少也影響了miRNA的積累。miR-383直接靶向HCC中的PARP2，而PARP2參與HCC的發(fā)展；miR-145直接靶向CDCA3，CDCA3降低了HCC患者的生存時間。熒光素酶測定證實miR-145可以沉默CDCA3的表達，miR-383可以沉默PARP2的表達。生物信息學分析顯示，PARP2的3′-UTR中有2個miR-383結(jié)合位點，CDCA3的3′-UTR 中有2個miR-145結(jié)合位點。此外，這2個基因在HCC中均過表達，并與HCC患者較短的OS相關(guān)。通過蛋白質(zhì)印跡檢測，發(fā)現(xiàn)PARP2和CDCA3蛋白也在CPSF4-KD細胞中降低，而在CPSF4-OE細胞中增加（圖 3E）。此外，這2種蛋白的表達與HCC中CPSF4的表達呈正相關(guān)。所有這些數(shù)據(jù)都證實了CPSF4介導的circRNA減少破壞了miRNA介導的基因沉默。
圖3 CPSF4減少了miRNA的積累和基因沉默
5、CPSF4拮抗hsa_circ_0004913的腫瘤抑制作用
在Bel7402和HepG2細胞中生成hsa_circ_0004913-OE細胞，然后用CPSF4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。分別通過蛋白質(zhì)印跡和實時PCR檢測每個細胞系中的CPSF4蛋白和hsa_circ_0004913表達水平（圖 4A，B）。與對照細胞相比，hsa_circ_0004913-OE細胞顯示出較慢的增殖和較低的克隆形成。然而，CPSF4的OE可以消除hsa_circ_0004913的腫瘤抑制作用，因為CPSF4轉(zhuǎn)染后生長速度和克隆形成能力恢復（圖 4C，D）。這些結(jié)果表明circRNA在CPSF4介導的HCC細胞腫瘤發(fā)生中的重要作用。
圖4 CPSF4拮抗hsa_circ_0004913的腫瘤抑制作用
文獻下載：
https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34103682
百邁客第八屆全國功能基因組學高峰論壇
1 峰會介紹
第八屆全國功能基因組學高峰論壇將于2021年10月18-22日震撼開啟。該峰會是中國基因產(chǎn)業(yè)具有影響力的行業(yè)峰會之一，為展示我國功能基因組學在多組學和大數(shù)據(jù)背景下重大研究進展，促進功能基因組學各研究領(lǐng)域的交流與合作，加強行業(yè)信息與資源的共享以及成果轉(zhuǎn)化，特舉辦本次高峰論壇，論壇規(guī)模逾1000人，在高通量測序技術(shù)、多組學分析方法及生物云蓬勃發(fā)展的背景下，本屆大會將邀請各界領(lǐng)域領(lǐng)軍者共同探索功能基因組學的新技術(shù)和新思路，以及大數(shù)據(jù)時代下的功能基因組學發(fā)展方向與未來！
2 峰會亮點
? 強勢陣容 陳潤生院士、康樂院士、鄧興旺院士、李蔚教授、湯富酬教授、郭國驥教授等60多位專家蒞臨，帶來全新前沿理念和技術(shù)
? 群英薈萃 100余家高校、科研院所，多學科、多領(lǐng)域精英與會
? 深度探討 對話學者，零距離面對面深度探討
? 大咖云集 十數(shù)家大咖企業(yè)匯聚一堂，引領(lǐng)大數(shù)據(jù)時代生物科技
? 現(xiàn)場體驗 百邁客生物云平臺動手實驗室現(xiàn)場體驗
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