單細(xì)胞核+空間轉(zhuǎn)錄組揭示膀胱癌免疫治療預(yù)后機(jī)制

膀胱癌患者接受免疫治療后預(yù)后效果的好壞仍然是臨床上面臨的一個(gè)主要的挑戰(zhàn)。近期NC一篇文章通過(guò)單細(xì)轉(zhuǎn)錄組及空間轉(zhuǎn)錄組闡述了對(duì)膀胱癌治療具有反應(yīng)應(yīng)答的癌細(xì)胞群。獲得了在預(yù)測(cè)對(duì)免疫治療的反應(yīng)方面更優(yōu)的marker基因。有助于為患者的治療提供更理想更優(yōu)的治療方案。

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英文題目：An N-Cadherin 2 expressing epithelial cell subpopulation predicts response to surgery,chemotherapy and immunotherapy in bladder cancer

中文題目：表達(dá)N-Cadherin 2的上皮細(xì)胞亞群預(yù)測(cè)膀胱癌對(duì)手術(shù)、化療和免疫治療的反應(yīng)

期刊：Nature Communications

IF：12.12

發(fā)表時(shí)間：2021

文獻(xiàn)鏈接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34385456

摘要

術(shù)前新輔助化療（NAC）和免疫檢查點(diǎn)治療（ICT）已經(jīng)徹底改變了膀胱癌的治療。然而，從這些模式中獲益最多的患者分層仍然是一個(gè)主要的臨床挑戰(zhàn)。作者將人類膀胱癌的單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞分辨率的空間蛋白組聯(lián)合分析，確定具有治療反應(yīng)預(yù)測(cè)能力的上皮細(xì)胞亞群。這些細(xì)胞表達(dá)Cadherin12（CDH12，N-Cadherin 2?）、catenins和其他上皮細(xì)胞的標(biāo)志物。CDH12富集的腫瘤可以定義患者是否接受NAC治療后預(yù)后效果差。富集CDH12的腫瘤對(duì)ICT表現(xiàn)出更好的效果。在所有情況下，通過(guò)對(duì)腫瘤CDH12富集進(jìn)行患者分層比目前膀胱癌亞型能更好的預(yù)后預(yù)測(cè)。CDH12群體類似于一種未分化的狀態(tài)，具有固有的侵略性生態(tài)學(xué)，包括化學(xué)耐藥性可能是通過(guò)祖細(xì)胞樣基因表達(dá)和成纖維細(xì)胞激活介導(dǎo)的。CDH12富集細(xì)胞表達(dá)PD-L1和PD-L2以及耗竭T細(xì)胞共定位，可能通過(guò)CD49a（ITGA1）介導(dǎo)，為ICT在腫瘤中的功效提供一種解釋?？傊?，本研究描述了一個(gè)對(duì)膀胱癌治療具有反向應(yīng)答的癌細(xì)胞群。重要的是還為臨床標(biāo)志物的篩選提供了一個(gè)令人信服的框架。

研究背景

肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌（MIBC）的分子分型改變了目前關(guān)于MIBC發(fā)病機(jī)制的概念。然而，即使是最近達(dá)成共識(shí)的分子分類系統(tǒng)也沒(méi)有為其在臨床決策中的應(yīng)用提供令人信服的證據(jù)，特別是缺乏對(duì)治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)。利用單細(xì)胞RNA測(cè)序分析MIBC的新興研究為腫瘤內(nèi)異質(zhì)性提供了初步認(rèn)識(shí)。然而，這些研究主要集中于腫瘤微環(huán)境，受限于相對(duì)較小的隊(duì)列規(guī)模，尚未提供一個(gè)更明確的治療決策途徑。在單細(xì)胞水平上的MIBC上皮和非上皮細(xì)胞的全面分析將有助于將當(dāng)前的分子亞型解轉(zhuǎn)到它們的組成部分，從而開(kāi)發(fā)出更有效的預(yù)后和預(yù)測(cè)工具。

材料方法

試驗(yàn)材料：25例MIBC患者和4例非膀胱癌對(duì)照的尿路上皮組織

試驗(yàn)方法：sn-RNAseq、空間轉(zhuǎn)錄組、TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)bulk數(shù)據(jù)、免疫組化

研究結(jié)果

1、表達(dá)CDH12上皮細(xì)胞的鑒定

為了實(shí)現(xiàn)表征腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的第一個(gè)目標(biāo)，作者首先基于sn-RNAseq細(xì)胞類型比例研究了MIBC腫瘤的總體細(xì)胞組成（圖1a）。腫瘤由約90%的上皮細(xì)胞、5%的免疫細(xì)胞、3%的成纖維細(xì)胞和2%的內(nèi)皮細(xì)胞組成，這些細(xì)胞根據(jù)相應(yīng)的角蛋白、PTPRC、膠原蛋白、PECAM1、VWF等關(guān)鍵標(biāo)記基因（圖1b）。上皮間室無(wú)監(jiān)督聚類識(shí)別到了一個(gè)KRT13和KRT17差異表達(dá)的類群，KRT13、uroplakins（UPK）、KRT6A細(xì)胞周期相關(guān)基因類群，以及表達(dá)CDH12和其他上皮標(biāo)記物的細(xì)胞群（圖1d）。KRT13和UPK人群是僅有的兩個(gè)缺乏來(lái)自免疫浸潤(rùn)MIBC的基因標(biāo)記的人群，這表明在這些人群中富集的腫瘤代表免疫“冷”腫瘤（圖1e）。進(jìn)一步交叉參照傳統(tǒng)的尿上皮分化相關(guān)標(biāo)記表明，KRT13和UPK群體代表一個(gè)更分化的表型，而CDH12、KRT6A和cycle群體代表一個(gè)未分化或去分化的表型（圖1f）。如預(yù)期一樣KRT13和UPK群體表達(dá)了一個(gè)上皮細(xì)胞分化網(wǎng)絡(luò)（圖1g）。基于單細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)推斷和聚類分析，預(yù)測(cè)CDH12群體表現(xiàn)出多種發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的高活性，包括NANOG、EOMES、PAX1和HOXD9（圖1h）。CDH12和循環(huán)群體在干-樣和神經(jīng)內(nèi)分泌基因標(biāo)簽得分也高（圖1i）。

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圖1?單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)CDH12+腫瘤細(xì)胞群

 

2、在健康正常的膀胱上皮細(xì)胞中可以發(fā)現(xiàn)富集CDH12的細(xì)胞

上皮細(xì)胞的無(wú)監(jiān)督聚類分為基礎(chǔ)、過(guò)渡和傘部類群（圖2a）。有趣的是CDH12群體與后一類典型群體明顯不同，而過(guò)渡群體的KRT13和KRT17表達(dá)水平最高（圖2b）。確定了一個(gè)始于基礎(chǔ)細(xì)胞的軌跡，隨后分化為兩種途徑：一種貫穿CDH12群體，一種跳過(guò)CDH12群體（圖2c和d）。關(guān)鍵的尿上皮分化標(biāo)記物沿著這條路徑跟蹤，在起始階段CD44高表達(dá)，隨后中間是KRT13和KRT17，終點(diǎn)站為UPK1A、GATA3、PPARG（圖2e）。所有4個(gè)正常樣本的擬時(shí)序分析顯示出相似的路徑，CDH12群位于起始點(diǎn)附近（圖2f）。為了確定CDH12腫瘤細(xì)胞與正常腫瘤細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)錄相似性，并推斷它們?cè)谡Ｉ掀ぜ?xì)胞分化軌跡上的位置，作者使用表達(dá)相似性，確定了每個(gè)MIBC上皮細(xì)胞中最接近的正常細(xì)胞，然后給腫瘤細(xì)胞分配相應(yīng)的正常潛伏期（圖2f）。值得注意的是，最未分化表型對(duì)應(yīng)的間隔得分預(yù)測(cè)了較差的疾病特異性生存（DSS），而最分化表型對(duì)應(yīng)的間隔得分預(yù)測(cè)了較好的DSS，中間的間隔得分顯示了相反結(jié)果之間的過(guò)渡（圖2f）。

圖2 CDH12+腫瘤群體類似于早期未分化尿路上皮細(xì)胞的特征并與較差的臨床結(jié)果相關(guān)

 

3、CDH12評(píng)分預(yù)測(cè)MIBC患者不良預(yù)后

? ? ? ?作者對(duì)TCGA每個(gè)腫瘤建立了細(xì)胞圖譜，并在MIBC或TCGA 2017分類共識(shí)背景下進(jìn)行了分析（圖3a）。有趣的是，由于其獨(dú)特的性質(zhì)，CDH12特征分布于Ba/Sq、腔內(nèi)浸潤(rùn)和神經(jīng)內(nèi)分泌樣亞型，而明顯不存在腔內(nèi)乳頭狀和腔內(nèi)不確定亞型（圖3a）。這與之前的觀察一致，即CDH12群體可能在某種程度上存在于多個(gè)先前建立的亞型中（圖1e）。CDH12和巨噬細(xì)胞信號(hào)是不良DSS的唯一預(yù)測(cè)因子（圖3b）。

圖3?高CDH12評(píng)分預(yù)測(cè)化學(xué)耐藥性和成纖維細(xì)胞活化

 

4、CDH12評(píng)分預(yù)測(cè)對(duì)新輔助化療的不良反應(yīng)

? ? ? ?作者觀察到低CDH12評(píng)分的樣本在化療后傾向于成為高CDH12評(píng)分的樣本，而高CDH12評(píng)分的樣本在化療后傾向于保持高CDH12評(píng)分（圖3c）。腫瘤開(kāi)始時(shí)CD8T評(píng)分較低，化療后CD8T評(píng)分增加，提示免疫激活。

5、CDH12細(xì)胞具有耐化療性并能激活基質(zhì)

? ? ? ? 有趣的是，在化療反應(yīng)中，CDH12評(píng)分較低的腫瘤細(xì)胞凋亡和免疫激活相關(guān)基因表達(dá)增加，而CDH12評(píng)分較低的腫瘤細(xì)胞表達(dá)增加CDH12評(píng)分通過(guò)纖維母細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞活化對(duì)化療有反應(yīng)（圖3d）。作者觀察到CDH12群體與成纖維細(xì)胞之間有許多顯著富集的相互作用，其中最顯著的是TGFBR1，CD44和一些整合素，因?yàn)樗鼈儏⑴c了癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）的激活（圖3e）。

6、CDH12評(píng)分預(yù)測(cè)化療后免疫治療反應(yīng)

? ? ? ? ? 通過(guò)免疫激活，作者發(fā)現(xiàn)低CDH12評(píng)分的腫瘤化療后PDCD1LG2（PDL2）表達(dá)增加，而在所有樣本中，PDL2表達(dá)高于PDL1（CD274）表達(dá)（圖4a）。之前的觀察與單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致，顯示CDH12細(xì)胞在上皮細(xì)胞中表達(dá)了最高水平的PDL2（圖4b）。化療后的樣本中，CDH12水平預(yù)示著更好的OS（圖4c）。此外，只有在化療后，CD8T評(píng)分和PDL1和PDL2的表達(dá)顯示了顯著的預(yù)后價(jià)值（圖4c）。CDH12評(píng)分也與化療后的病理反應(yīng)相關(guān)，事實(shí)上，它是與化療后反應(yīng)顯著相關(guān)的唯一因素，甚至考慮到已建立的一致MIBC亞型（圖4d和e）。

圖4化療后CDH12評(píng)分預(yù)測(cè)免疫檢查點(diǎn)治療的良好反應(yīng)

7、CDH12細(xì)胞通過(guò)CD49a和CD8 T細(xì)胞相互作用

? ? ? ? 雖然作者再次發(fā)現(xiàn)CDH12上皮細(xì)胞和T細(xì)胞之間有許多顯著的相互作用，但作者發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的相互作用是在CD8 T細(xì)胞上編碼CD49a的ITGA1（圖4f）。在有針對(duì)性的檢查點(diǎn)交互分析中，作者發(fā)現(xiàn)CDH12群體與CD8T細(xì)胞具有最強(qiáng)的PDL2-PD1和CTLA-4互作，而KRT13和UPK群體通過(guò)TIGIT和TIM-3與CD8T細(xì)胞互作（圖4g）。

8、CDH12細(xì)胞與CD8 T細(xì)胞共定位

為了驗(yàn)證CDH12上皮細(xì)胞引起T細(xì)胞假說(shuō)，作者使用Visium空間轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組研究腫瘤中基因表達(dá)定位。CDH12富集的區(qū)域也富集了CD8T細(xì)胞marker和ITGA1（圖5a）。為了驗(yàn)證CDH12上皮細(xì)胞在單細(xì)胞水平上與T細(xì)胞共定位，作者設(shè)計(jì)并使用CODEX平臺(tái)對(duì)同一腫瘤隊(duì)列的腫瘤組織微陣列進(jìn)行了35位免疫組化檢測(cè)（圖5b）。

圖5 CDH12腫瘤細(xì)胞優(yōu)先與表達(dá)CD49a、PD-1和LAG3的T細(xì)胞共定位

 

9、CDH12細(xì)胞用耗竭的CD8 T細(xì)胞定義細(xì)胞生態(tài)位

? ? ? ? ?與Visium空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果一致，作者再次使用k近鄰法觀察到CD8T與CDH12上皮細(xì)胞比KRT13上皮細(xì)胞更接近（圖5c）。相比之下，作者鑒定了2個(gè)KRT13上皮細(xì)胞富集CD8T細(xì)胞未富集的CNs（圖5d）。此外，根據(jù)shannon指數(shù)評(píng)發(fā)現(xiàn)CDH12富集的CNs在其組成的細(xì)胞類型上比KRT13富集的CNs更具多樣化（圖5e）。

? ? ? ? CDT8細(xì)胞存在的CDH12富集的CNs相比于非CDH12富集的CNs，CD49a、PD-1和LAG3高表達(dá)（圖5f和g）。相反，左側(cè)表達(dá)PD-L2水平較低；三個(gè)相關(guān)的CNs中，CN14含有PD-L1和PD-L2表達(dá)最高的CDH12細(xì)胞這與LAG3表達(dá)最高的CD8T細(xì)胞一致，促進(jìn)CD8T細(xì)胞的耐受性狀和PD-1的衰竭（圖5f和h）。

研究結(jié)論

? ? ? ? 總之，作者第一次進(jìn)行了MIBC單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組闡明當(dāng)前分子亞型的組成，并獲得更高分辨率的具有治療相關(guān)性的分子標(biāo)記。作者獲得了與特定細(xì)胞群、尿上皮分化和瘤內(nèi)空間鄰近相關(guān)的標(biāo)記基因，這些標(biāo)記基因提供了比先前基于bulk亞型更優(yōu)的治療相關(guān)性（圖6a）。通過(guò)這些發(fā)現(xiàn)作者推測(cè)基因表達(dá)譜可以幫助患者分類是否受益于NAC（圖6b）。NAC后腫瘤低C3評(píng)分可能受益于靶向替代免疫檢查點(diǎn)途徑如TIM3或TIGIT，而高表達(dá)的腫瘤可能受益于單藥或聯(lián)合ICT（圖6b）。還為一些基于NAC前C3的評(píng)分高的腫瘤患者以及NAC后殘留疾病患者臨床試驗(yàn)提供了令人信服的理由（圖6b）。