WGCNA簡介
WGCNA(Weighted Gene Co-Expression Network Analysis, 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析)，是用來描述不同樣品之間基因關(guān)聯(lián)模式的系統(tǒng)生物學(xué)方法?？设b定表達(dá)模式相似的基因集合（module），解析基因集合與樣品表型之間的聯(lián)系，繪制基因集合中基因之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并鑒定關(guān)鍵調(diào)控基因。要了解 WGCNA, 首先需要理解什么是基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。我們定義每個(gè)節(jié)點(diǎn)為一個(gè)基因，在不同樣本中存在表達(dá)共性的基因處于同一個(gè)基因網(wǎng)絡(luò)，而基因之間的共表達(dá)關(guān)系一般由它們之間的表達(dá)相關(guān)系數(shù)衡量。WGCNA 算法首先假定基因網(wǎng)絡(luò)服從無尺度分布,并定義基因共表達(dá)相關(guān)矩陣、基因網(wǎng)絡(luò)形成的鄰接函數(shù),然后計(jì)算不同節(jié)點(diǎn)的相異系數(shù),并據(jù)此構(gòu)建分層聚類樹(hierarchical clustering tree),該聚類樹的不同分支代表不同的基因模塊(module),模塊基因共表達(dá)程度高,而分屬不同模塊的基因共表達(dá)程度低。最后探索模塊與特定表型或疾病的關(guān)聯(lián)關(guān)系,最終達(dá)到鑒定基因網(wǎng)絡(luò)的目的。
結(jié)果說明
1. 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)熱圖分析
WGCNA的核心步驟其實(shí)就是通過對(duì)TOM矩陣進(jìn)行分層聚類，TOM (Topological overlap matrix)即為把鄰接矩陣轉(zhuǎn)換為拓?fù)渲丿B矩陣，以降低噪音和假相關(guān)，獲得的新距離矩陣，可以用來計(jì)算基因之間關(guān)聯(lián)程度?；赥OM矩陣，圖A中的行和列均代表基因，灰色模塊為無法分配到初級(jí)模塊中的基因，樹枝的頂端為核心基因，顏色越深代表TOM值越高。熱圖中方塊的顏色越深（紅）表示共表達(dá)相關(guān)性越高，越淺（黃）表示相關(guān)性越弱。
2. 模塊間相關(guān)性熱圖
下圖展示模塊與模塊間的相關(guān)性。橫軸縱軸分別代表不同的模塊，相關(guān)性越弱則呈現(xiàn)藍(lán)色，相關(guān)性越強(qiáng)則呈現(xiàn)紅色。
3. 模塊與性狀間的熱圖
模塊與性狀相關(guān)性熱圖：下圖展示模塊與給定性狀的相關(guān)系熱圖。某一性狀與某一模塊的相關(guān)性越接近 1 的絕對(duì)值，很可能此性狀與模塊的基因功能相關(guān)。橫軸代表著性狀，縱軸代表著模塊（下圖中我們沒有選擇性狀，所以展示的是樣品的名稱）。
4.基因表達(dá)量的樣本系統(tǒng)聚類樹
基于基因表達(dá)量的樣本系統(tǒng)聚類樹: 在聚類中歐氏距離求兩點(diǎn)的距離，聚類中用類平均法(average)計(jì)算集合之間的距離。同一枝上的樣本具有更高的相似性。
5.樣本系統(tǒng)聚類樹及相關(guān)性狀熱圖
在基因表達(dá)量的樣本系統(tǒng)聚類樹的基礎(chǔ)上我們添加了熱圖，樣本與性狀之間的相關(guān)性越高熱圖中模塊顏色也會(huì)越深。例如我們將熱圖左邊的T01看作是性狀標(biāo)簽，它與分支樣本TP01的熱圖模塊呈現(xiàn)紅色，說明性狀T01與樣本T01的相關(guān)性非常高。
6.基因的系統(tǒng)樹圖及性狀相關(guān)性熱圖
基因的系統(tǒng)樹圖及性狀相關(guān)性熱圖主要分為三個(gè)部分：第一個(gè)部分為基因聚類繪制的聚類樹，分枝代表基因；第二部分為基因聚類樹根據(jù)不同的聚類對(duì)應(yīng)到的不同模塊；第三部分為性狀的熱圖，如圖中T01~T06為性狀，對(duì)應(yīng)熱圖中的顏色越深，說明該模塊中的基因與該性狀的相關(guān)性越高。
7.樣品 PCA 分析二/三維圖
PCA分析橫坐標(biāo)代表著第一主成分，縱坐標(biāo)代表第二主成分，可以根據(jù)圖看出在第一主成分方向上樣本的距離越近，說明它們的主成分越相近，相關(guān)性越高。
8.基因網(wǎng)絡(luò)模塊
基因網(wǎng)絡(luò)模塊主要分為三個(gè)部分：第一部分為基因的聚類樹；第二部分為根據(jù)基因聚類樹劃分的不同模塊；第三部分為根據(jù)第二部分模塊進(jìn)行了矯正，最后結(jié)果為校正后的模塊。
9．模塊COG/KEGG/GO二級(jí)分類圖
將每一個(gè)模塊中的基因繪制了跟它功能相關(guān)的COG/KEGG/GO分類富集圖。
在COG富集分析中橫軸代表功能分類，縱軸代表基因頻數(shù)。
在GO富集分析中橫軸代表GO term，左側(cè)縱軸代表基因占比，右側(cè)為基因的數(shù)目。
在KEGG富集中縱軸代表路徑，橫軸代表注釋到的基因數(shù)目
GSEA介紹
基因集富集分析(GSEA: Gene Set Enrichment Analysis)，可以在沒有先驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)存在的情況下根據(jù)所有基因表達(dá)情況對(duì)所有基因進(jìn)行富集分析。一般的差異分析通常只集中關(guān)注于一些顯著的上調(diào)或下調(diào)基因，而這會(huì)遺漏部分差異表達(dá)不顯著卻有重要生物學(xué)意義的基因。而GSEA不會(huì)設(shè)置差異閾值，能夠檢測(cè)出微弱但是一致的趨勢(shì)。其輸入數(shù)據(jù)包含兩部分：一為已知功能的基因集 (可以是GO注釋、MsigDB的注釋或其它符合格式的基因集定義)；二是表達(dá)矩陣 (也可以是排序好的列表)。
軟件會(huì)對(duì)基因根據(jù)其與表型的關(guān)聯(lián)度從大到小排序，然后判斷基因集內(nèi)每條注釋下的基因是否富集于表型相關(guān)度排序后基因表的上部或下部，從而判斷此基因集內(nèi)基因的協(xié)同變化對(duì)表型變化的影響。
結(jié)果說明
百邁客中的GSEA分析采用KEGG通路以及GO的BP、CC、MF分支的基因集作為感興趣的基因集合，以每個(gè)差異分組的log2FC作為背景基因集的打分來分析感興趣基因集合的富集情況，最后控制pvalue<0.001，F(xiàn)DR 圖片
GSEA計(jì)算中幾個(gè)關(guān)鍵概念
1、計(jì)算富集得分 (ES, enrichment score)。ES反應(yīng)基因集成員(差異基因)在排序總基因列表的兩端富集的程度。計(jì)算方式是，從總基因集的第一個(gè)基因開始，計(jì)算一個(gè)累計(jì)統(tǒng)計(jì)值。當(dāng)遇到一個(gè)落在差異基因里面，則增加統(tǒng)計(jì)值。遇到一個(gè)不在差異基因里面，則降低統(tǒng)計(jì)值。
2、每一步統(tǒng)計(jì)值增加或減少的幅度與基因的表達(dá)變化程度（更嚴(yán)格的是與基因和表型的關(guān)聯(lián)度，可能是fold-change，也可能是pearson corelation值，后面有介紹幾種不同的計(jì)算方式）是相關(guān)的，可以是線性相關(guān)，也可以是指數(shù)相關(guān) （具體見后面參數(shù)選擇）。富集得分ES最后定義為峰值。正值ES表示基因集在列表的頂部富集，負(fù)值ES表示基因集在列表的底部富集。
3、評(píng)估富集得分(ES)的顯著性。通過基于表型而不改變基因之間關(guān)系的排列檢驗(yàn) (permutation test)計(jì)算觀察到的富集得分(ES)出現(xiàn)的可能性。若樣品量少，也可基于基因集做排列檢驗(yàn) (permutation test)，計(jì)算p-value。
4、多重假設(shè)檢驗(yàn)校正。首先對(duì)每個(gè)差異基因子集計(jì)算得到的ES根據(jù)基因集的大小進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化得到Normalized Enrichment Score (NES)，隨后針對(duì)NES計(jì)算假陽性率。（計(jì)算NES也有另外一種方法，是計(jì)算出的ES除以排列檢驗(yàn)得到的所有ES的平均值）Leading-edge subset為對(duì)富集得分貢獻(xiàn)大的基因成員。
從前文中我們了解到GSEA分析的目的是要判斷差異集基因（基于先驗(yàn)知識(shí)的基因注釋信息，某個(gè)關(guān)注的基因集合）中的基因是隨機(jī)分布還是聚集在排序好的總基因集的頂部或底部（這便是富集分析）。與GO富集分析的差異在于GSEA分析不需要指定閾值（p值或FDR）來篩選差異基因，我們可以在沒有經(jīng)驗(yàn)存在的情況下分析我們感興趣的基因集，而這個(gè)基因集不一定是顯著差異表達(dá)的基因。GSEA分析可以將那些GO/KEGG富集分信息中容易遺漏掉的差異表達(dá)不顯著卻有著重要生物學(xué)意義的基因包含在內(nèi)。
蛋白網(wǎng)絡(luò)互作
蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（protein protein interaction network，PPI network）是由蛋白通過彼此之間的相互作用構(gòu)成，來參與生物信號(hào)傳遞、基因表達(dá)調(diào)節(jié)、能量和物質(zhì)代謝及細(xì)胞周期調(diào)控等生命過程的各個(gè)環(huán)節(jié)。系統(tǒng)分析大量蛋白在生物系統(tǒng)中的相互作用關(guān)系，對(duì)了解生物系統(tǒng)中蛋白質(zhì)的工作原理，了解疾病等特殊生理狀態(tài)下生物信號(hào)和能量物質(zhì)代謝的反應(yīng)機(jī)制，以及了解蛋白之間的功能聯(lián)系都有重要意義。在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有助于從系統(tǒng)的角度研究疾病分子機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新藥靶點(diǎn)等等。
主要主要是基STRING數(shù)據(jù)庫提取目標(biāo)基因集的互作關(guān)系。對(duì)于數(shù)據(jù)庫中未收錄信息的物種，使用BLAST軟件，將目的基因與數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)進(jìn)行序列比對(duì)，尋找同源蛋白，根據(jù)同源蛋白的互作關(guān)系對(duì)構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)。構(gòu)建完成的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)可導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化。
圖片
結(jié)果說明
如圖中的節(jié)點(diǎn)為蛋白質(zhì)，邊為互作關(guān)系?；プ骶W(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)(node)的大小與此節(jié)點(diǎn)的度(degree)成正比，即與此節(jié)點(diǎn)相連的邊越多，它的度越大，節(jié)點(diǎn)也就越大。節(jié)點(diǎn)的顏色與此節(jié)點(diǎn)的聚集系數(shù)(clustering coefficient)相關(guān)，顏色梯度由綠到紅對(duì)應(yīng)聚集系數(shù)的值由低到高，聚集系數(shù)值越高表示此節(jié)點(diǎn)的鄰接點(diǎn)之間的連通性越好。邊(edge)的寬度表示此邊連接的兩個(gè)節(jié)點(diǎn)間的互相作用的關(guān)系強(qiáng)弱，互相作用的關(guān)系越強(qiáng)，邊越寬。沒有的組合代表沒有互作關(guān)系。
圖片
百邁客轉(zhuǎn)錄組測(cè)序服務(wù)針對(duì)不同樣品類型采用全面解析mRNA信息的策略，不僅能獲得樣本的轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄豐度信息，還能探究相關(guān)基因結(jié)構(gòu)變異(SNP、CNV、SV、 Indel等)。此外，百邁客云的生物大數(shù)據(jù)分析平臺(tái)，可以深入挖掘差異表達(dá)基因，完成多種高級(jí)分析內(nèi)容，例如上文提到的WGCNA、GSEA、PPI等內(nèi)容，為您提供全面、高效的生物信息分析以及整合利用公共數(shù)據(jù)庫的解決方案。
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