合作文章|Nat Cell Biol|線粒體定位的ZNFX1充當dsRNA傳感器通過MAVS啟動抗病毒反應

2019年11月2日Nat Cell Biol雜志在線發(fā)表了題為“Mitochondria-localised ZNFX1 functions as a dsRNA sensor to initiate antiviral responses through MAVS”的文章，該文章由中山大學生命科學學院徐安龍教授團隊完成，其中RNA-seq部分由百邁客協(xié)助完成，詳細情況如下：

英文題目：Mitochondria-localised ZNFX1 functions as a dsRNA sensor to initiate antiviral responses through MAVS

中文題目：線粒體定位的ZNFX1充當dsRNA傳感器通過MAVS啟動抗病毒反應

發(fā)表雜志：Nature Cell Biology，2019

影響因子：17.728

合作單位：中山大學生命科學學院

小編悄悄告訴您，近期百邁客醫(yī)學的高分合作文章不少，趁著年前陸續(xù)解讀給各位fans，咱們也看看人家是如何設計文章思路的。

 

研究背景

過去的二十年的研究表明，屬于解旋酶超家族2（SF2）的DExD/H-bo解旋酶在抗病毒先天免疫中起著至關重要的作用。但是，與SF2共享一個保守的解旋酶核心(兩個串聯(lián)的RecA域組成，具有ATPase活性和RNA結(jié)合能力)的解旋酶SF1的抗病毒功能鮮為人知。

病毒衍生的核酸與胞質(zhì)病毒傳感器結(jié)合后，可以募集兩個配體MAVS和STING來誘導I型干擾素(IFN)的產(chǎn)生以及許多具有抗病毒活性的干擾素刺激基因（ Interferon Stimulated Genes,ISG）。這些ISGs在多種抗病毒免疫水平上發(fā)揮著多種功能，比如ISGs可抑制特定的病毒生命周期階段，此外，某些ISGs還可以增強先天病原體的識別能力或積極調(diào)節(jié)IFN信號傳導。

研究目的：

確定很少研究的解旋酶SF1的抗病毒功能并鑒定更多ISGs。

研究方法

已發(fā)表數(shù)據(jù)重新挖掘：水皰性口炎病毒（VSV）感染的人單核細胞衍生巨噬細胞（MDM）的IVT-SAPAS（in vitro transcription-sequencing alternative polyadenylation sites）時間梯度數(shù)據(jù)，篩選新的可能基因–包含ZNFX1。
關鍵基因抗病毒作用驗證：1）敲減關鍵基因表達，VSV-eGFP感染檢測這些基因的抗病毒活性–初步證實ZNFX1參與抗病毒反應；2）qRT-PCR或免疫印跡分析VSV感染或干擾素誘導劑聚肌胞苷酸(poly(I:C))刺激各細胞系或小鼠后組織中ZNFX1表達改變；3）病毒感染公共數(shù)據(jù)挖掘，感染后ZNFX1表達上調(diào)；

ZNFX1為干擾素刺激基因ISG驗證：人重組IFN-α和IFN-β孵育實驗、JAK1抑制劑魯索替尼(ruxolitinib)、Ifnar1敲除后qRT-PCR和免疫印跡分析ZNFX1表達水平；轉(zhuǎn)錄因子預測及轉(zhuǎn)錄因子motif缺失和WT報告基因試驗證實其病毒感染后的上調(diào)取決于JAK1-STAT1級聯(lián)反應。

體外和在體實驗證明ZNFX1抗RNA病毒天然免疫調(diào)控作用：A549、L929細胞、293T細胞、小鼠等siRNA沉默或Crispr-cas9敲除VSV感染實驗，ZNFX1過表達和對照組A549細胞轉(zhuǎn)錄組測序分析其影響的信號通路。

ZNFX1與IFN信號傳導：ZNFX1過表達質(zhì)粒和Ifnb1-reporter或IFN刺激的應答元件（ISRE）報告質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染A549細胞進行螢光素酶報告基因分析，然后進行或不進行VSV感染，等實驗證實ZNFX1通過誘導I型IFN的產(chǎn)生而參與抗病毒免疫反應，其抗病毒特性也取決于IFN信號傳導。

ZNFX1與病毒RNA結(jié)合：pulldown實驗和RIP-seq等；

ZNFX1線粒體定位以及互作的IFN產(chǎn)生相關adaptor分析：不同組分分離WB、顯微共聚焦實驗、Co-IP實驗、線粒體組分分離及蛋白酶保護測定等；poly(I:C)處理與否的Rig-I-/-A549細胞RNA-seq，空載EV、ZNFX1過表達、EV+poly(I:C)、ZNFX1+poly(I:C)，共計4組；等

 

研究結(jié)果

1、病毒感染誘導ZNFX1表達

作者首先分析了他們先前發(fā)表的被水皰性口炎病毒（VSV）感染的單核細胞衍生巨噬細胞（MDM）的IVT-SAPAS（in vitro transcription-sequencing alternative polyadenylation sites）數(shù)據(jù)，并發(fā)現(xiàn)了許多表達改變的基因?！局耙寻l(fā)表文章的數(shù)據(jù)重新挖掘】通過比較受VSV感染的人MDM數(shù)據(jù)和小鼠腹膜巨噬細胞數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了一些共同的基因，它們被上調(diào)了三倍以上，包括FFAR2，ZEB2，TIPAP，PTGS2，CMPK2，ZNFX1和CSRNP1。隨后敲除A549細胞中的這些基因，用VSV-eGFP（VSV-增強型綠色熒光蛋白）感染細胞，流式細胞術檢測GFP陽性細胞的百分比表明，敲減ZNFX1（其抗病毒作用尚未見報道）促進了VSV感染。

補充圖1

研究表明，屬于RNA解旋酶SF2的DExD/H-box RNA解旋酶在抗病毒免疫反應中起著多種作用。ZNFX1是RNA解旋酶SF1的代表，它包含一個ARM(Armadillo-type fold)域、一個P環(huán)解旋酶域和一個鋅指（ZF）域。因為來自解旋酶SF1和SF2的基因共享一個保守的核心結(jié)構(gòu)，以兩個串聯(lián)的RecA域為特征，所以作者認為SF1也可能在抗病毒免疫中發(fā)揮重要作用。

為驗證假設，作者使用IVT-SAPAS數(shù)據(jù)分析了SF1和SF2的基因表達譜，發(fā)現(xiàn)這兩個亞家族中的許多基因在VSV感染后表達都有變化（圖1a）。流式細胞儀分析結(jié)果表明，敲低A549細胞中的MOV10、HELZ2、UPF1和ZNFX1導致VSV復制明顯增強，而敲除SEXT引起相反的結(jié)果。MOV10、UPF1和SEXT以前被報道與抗病毒免疫有關，驗證了基于RNAi和病毒感染的篩選方法有效，并暗示ZNFX1可能是未發(fā)現(xiàn)的抗病毒分子。

為了更深入地了解ZNFX1在抗病毒應答中的作用，進行了qRT-PCR或免疫印跡分析，以了解VSV感染或干擾素誘導劑聚肌胞苷酸(poly(I:C))刺激A549細胞、外周血單個核細胞（PBMC）或小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）細胞后ZNFX1的表達上調(diào)（圖1b–d）。qRT-PCR也證實了靜脈注射VSV后小鼠脾臟和肺中Znfx1的豐度上調(diào)（包括胸腺、淋巴結(jié)脾臟和肺）（圖1e）。作者還對先前收集的芯片數(shù)據(jù)集（GDS4231/4214/1271/3210/6082/6063）進行了統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)與健康對照相比，在HIV感染患者和猿猴免疫缺陷病毒（SIV）引起的腦炎猴子中，Znfx1的RNA水平明顯更高（圖1f,g）。此外，在不同的細胞類型（包括巨噬細胞、樹突狀細胞和上皮細胞）中感染病毒后，Znfx1的轉(zhuǎn)錄顯著增加。這些數(shù)據(jù)都表明ZNFX1可能是抗病毒分子。

圖1_上

2、ZNFX1是干擾素刺激基因ISG

由于病毒感染導致ZNFX1的mRNA和蛋白質(zhì)水平表達均增強，接下來通過將A549細胞與人重組IFN-α和IFN-β一起孵育來檢測ZNFX1是否為ISG。qRT-PCR和免疫印跡分析的結(jié)果表明ZNFX1的表達可以被IFN-α和IFN-β誘導（圖1h,i）。相比之下，JAK1抑制劑魯索替尼(ruxolitinib)可以抑制VSV對Znfx1 mRNA的誘導，并且在Ifnar1-/-A549細胞中幾乎消失（圖1j,k）。

圖1_下

為了確定哪些核苷酸和區(qū)域Znfx1轉(zhuǎn)錄中很重要，使用promoter 2.0（ http://www.cbs.dtu.dk/services/promoter/）、JASPAR（http://jaspar.genereg.net/）和CpGplot（http://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/）進行識別，其中包含TATA框、GC框和CAAT框的Znfx1的-1,064~+63之間的區(qū)域，是啟動子。對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的進一步分析表明，Znfx1的啟動子在相對集中和重疊的區(qū)域中包含STAT1、STAT2、IRF1和IRF9結(jié)合基序?；谶@些分析，構(gòu)建了一個Znfx1啟動子報告基因載體，包含?1,064~+63之間的區(qū)域，以及一個突變的報告基因構(gòu)建體，其中缺失了STAT1、STAT2、IRF1和IRF9結(jié)合motif。接下來，STAT1，STAT2，IRF1或IRF9過表達質(zhì)粒和2個報告基因載體轉(zhuǎn)染293T細胞，報告基因分析表明，在STAT1、STAT2、IRF1或IRF9存在的情況下，報告基因的表達可以由Znfx1啟動子誘導，而不能由缺少轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的啟動子載體誘導（圖1l）?？偠灾?，ZNFX1是一個ISG，其病毒感染后的上調(diào)取決于JAK1-STAT1級聯(lián)反應。

3、ZNFX1對于抗RNA病毒天然免疫至關重要

為了進一步探討ZNFX1在抗病毒免疫反應中的作用，作者沉默了A549和L929細胞中ZNFX1的內(nèi)源性表達，用VSV-eGFP感染，并進行流式細胞儀分析。結(jié)果表明，Znfx1的敲低顯著增強了A549和L929細胞中的VSV復制（圖2a）。同時，在Znfx1沉默細胞中觀察到更高的VSV滴度和增加的VSV-G蛋白（圖2b,c）。一致地，在VSV感染或poly(I:C)刺激后，敲低Znfx1表達可顯著降低A549細胞中IFN-α和IFN-β蛋白的產(chǎn)生。相反，當ZNFX1過表達時，在A549細胞中觀察到了較低的VSV mRNA和VSV滴度。

為了獲得ZNFX1在抗病毒反應中的更多功能證據(jù)，采CRISPR介導的基因組編輯方法敲除293T和A549細胞中的Znfx1。同樣發(fā)現(xiàn)293T和A549細胞中敲除Znfx1增強了VSV復制（圖2d）。同時，在野生型或Znfx1-/-A549細胞中ZNFX1的過表達限制了VSV復制（圖2e）。進一步的RNA-seq分析比較了野生型對照和ZNFX1過表達的A549細胞之間差異表達基因，結(jié)果顯示參與病毒復制和I型IFN信號轉(zhuǎn)導負調(diào)控的上調(diào)基因顯著富集（圖2f）。有趣的是，在腦心肌炎病毒EMCV和甲型流感病毒（H1N1）感染的Znfx1敲低的A549細胞中，病毒mRNA水平升高，但在單純皰疹病毒1型（HSV-1）感染后并未顯著改變，表明ZNFX1具有廣泛的抗RNA病毒譜 。

圖2_上

為了研究ZNFX1在體內(nèi)的生理作用，使用CRISPR/Cas系統(tǒng)生成了Znfx1-/-C57BL/6J小鼠。Znfx1-/-小鼠存活，沒有明顯的生理或行為異常。在這項研究中使用了六至八周大的小鼠。首先，分離野生型和Znfx1-/-小鼠的BMDM并用VSV、EMCV、H1N1或HSV-1感染，與野生型相比，Znfx1-/-BMDM的IFN-α或IFN-β分泌較低。RNA病毒感染后，包括VSV、EMCV和H1N1，但不包括HSV-1（圖2g），Znfx1-/-BMDM中檢測到較高的病毒mRNA水平，但在HSV-1感染的細胞中未檢測到較高的病毒mRNA水平（圖2h）。與野生型相比，Znfx1-/- MEF和A549細胞在RNA病毒感染VSV和EMCV后表現(xiàn)出較低的IFN-β分泌（圖2i,j）。

圖2_下

ZNFX1在宿主體內(nèi)對抗病毒感染的防御中的重要性：通過尾靜脈向野生型和Znfx1-/-小鼠注射了VSV。與野生型小鼠相比，Znfx1-/-小鼠的肺和肝中的VSV復制增強了（圖3a），隨著肺和肝中Ifnb1表達的減少，在Znfx1-/-小鼠中血清中IFN-α和IFN-β的分泌降低（圖3b，c）。而HSV-1感染后，Znfx1-/-和野生型小鼠之間血清中的IFN-α和IFN-β沒有差異（圖3c）。有趣的是，VSV感染一天后，Znfx1-/-小鼠中有80％患有結(jié)膜炎，這是VSV感染的早期癥狀（圖3d）。另外，觀察到VSV感染后炎性細胞更多地滲透到Znfx1-/-小鼠的肺中（圖3e），并且Znfx1-/-小鼠在存活試驗中對VSV感染的抵抗力較弱（圖3f）。這些數(shù)據(jù)表明，Znfx1缺乏后體內(nèi)產(chǎn)生較少的I型IFN，削弱了針對RNA病毒感染的先天免疫反應。總之，ZNFX1專門針對RNA病毒發(fā)揮其抗病毒特性。

圖3

4、ZNFX1啟動基于IFN的抗病毒反應

為了研究ZNFX1在IFN信號傳導中的作用，通過ZNFX1過表達質(zhì)粒和Ifnb1-reporter或IFN刺激的應答元件（ISRE）報告質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染A549細胞進行螢光素酶報告基因分析，然后進行或不進行VSV感染。結(jié)果表明，ZNFX1的過表達輕微激活了Ifnb1啟動子和ISRE報告基因（圖4a）。此外，ZNFX1以劑量依賴的方式顯著增強了由VSV、2種類型的poly(I:C)或poly(dA:dT)觸發(fā)的Ifnb1啟動子激活（圖4b,c）。相反，敲除Znfx1可降低VSV誘導的293T細胞中Ifnb1報告基因和ISRE報告基因的激活（圖4d）。Ifnb1和ISGs的轉(zhuǎn)錄以劑量和時間依賴性的方式誘導（圖4e），當ZNFX1在A549細胞中過表達時隨著劑量和時間增強反之敲除ZNFX1則降低。而與野生型細胞相比，Znfx1-/-A549和MEF細胞中ISG蛋白表達量分別減少（圖4f）。VSV感染后Znfx1-/-巨噬細胞中TBK1和IRF3的磷酸化低于野生型巨噬細胞（圖4g）。在VSV感染的Znfx1-/-293T細胞中，IRF3的二聚化也低于野生型細胞（圖4h）。野生型A549細胞中觀察到了VSV的限制性復制，但在Ifnar1-/-A549細胞中未觀察到（圖4i）。所有這些數(shù)據(jù)表明，ZNFX1通過誘導I型IFN的產(chǎn)生而參與抗病毒免疫反應，其抗病毒特性也取決于IFN信號傳導。

圖4

5、ZNFX1直接結(jié)合病毒RNA

屬于RNA解旋酶SF2的許多基因被鑒定為結(jié)合病毒RNA的RNA病毒傳感器，因此假設屬于SF1的ZNFX1也可能作為RNA傳感器結(jié)合病毒RNA。為證實這一假設，首先在293T細胞中過表達ZNFX1，然后進行pulldown和qRT-PCR分析以確定ZNFX1與VSV-RNA的高結(jié)合能力（圖5a,b）。也檢測了內(nèi)源性ZNFX1與A549細胞中的VSV，EMCV和仙臺病毒（SeV）RNA的結(jié)合能力（圖5c）。通過用抗內(nèi)源性ZNFX1的抗體從免疫沉淀物中分離RNA來進行RNA免疫沉淀（RIP）測序分析，將ZNFX1相關的RNA比對到VSV基因組（圖5d），優(yōu)先定位于約6,000-8,000 nt的VSV片段（圖5e）。值得注意的是，當與ZNFX1相關的RNA轉(zhuǎn)染到A549細胞中時，通過qRT-PCR和熒光素酶活性分析觀察到了Ifnb1的誘導轉(zhuǎn)錄和基于Ifnb1啟動子的報告基因的誘導表達（圖5f）。

為了進一步評估與ZNFX1結(jié)合的病毒RNA的性質(zhì)，首先將核酸類似物連接的磁珠與經(jīng)Flag標記的ZNFX1、RIG-I或MAVS過表達的293T細胞裂解液一起孵育，并進行了pulldown試驗以顯示ZNFX1和RIG-I蛋白與poly(I:C)結(jié)合，但不與poly(C)結(jié)合（圖5g）。cGAS而非ZNFX1結(jié)合單鏈和雙鏈DNA（ISD，一個45 bp的雙鏈DNA；圖5h）。競爭實驗顯示ZNFX1蛋白與HMW poly(I:C)優(yōu)先結(jié)合，而不是與LMW poly(I:C)、poly(dA:dT)或5’pppdsRNA優(yōu)先結(jié)合（圖5i）。為了找到ZNFX1的poly(I:C)結(jié)合位點，準備了ZNFX1的截短版本并進行了poly(I:C) pulldown實驗。結(jié)果表明，ZNFX1與poly(I:C)的結(jié)合需要ARM域和P環(huán)結(jié)構(gòu)域，而不是ZF鋅指域（圖5j）。病毒感染后ZNFX1的寡聚化增強（圖5k,1）。因此，ZNFX1充當RNA病毒傳感器，它傾向于結(jié)合長RNA分子。

 

圖5

7、ZNFX1定位于線粒體并與MAVS相互作用

為了確定ZNFX1的亞細胞定位，將受VSV感染的細胞分為細胞質(zhì)和細胞核部分，主要在細胞質(zhì)中檢測到ZNFX1蛋白（圖6a）。以前有關含ARM域的蛋白ALEX3和ARM1的研究表明，這些蛋白是線粒體定位的。因此，通過免疫印跡分析確定ZNFX1是否也可以定位于該免疫相關細胞器上。結(jié)果顯示，從VSV感染的細胞中分離出的線粒體部分中ZNFX1蛋白量增加（圖6a）。共聚焦顯微鏡證實過表達的ZNFX1蛋白與線粒體共定位，病毒感染后觀察到ZNFX1斑點擴大（圖6b）。為了進一步探索ZNFX1的線粒體定位，進行了蛋白酶保護測定。如圖6c所示，當用不含Triton X-100的蛋白酶K處理線粒體時，MAVS和大多數(shù)ZNFX1蛋白被消化，表明ZNFX1是線粒體外膜蛋白。相反，細胞色素c氧化酶亞基IV（COX IV）是線粒體內(nèi)膜蛋白，對蛋白酶K消化有抵抗力。進一步對線粒體進行堿提取，回收具有外周膜蛋白的上清液和具有完整膜蛋白的沉淀物，發(fā)現(xiàn)外膜整合蛋白MAVS主要在提取后的沉淀中回收，但在2個餾分中均觀察到了COX IV。ZNFX1在上清液中大量回收（圖6c），表明ZNFX1作為外周膜蛋白定位于線粒體，如先前報道中的SARM1和ALEX3。

為了進一步表征ZNFX1在感測病毒RNA時如何轉(zhuǎn)導抗病毒信號，檢查了ZNFX1與涉及IFN產(chǎn)生的配體（包括TRIF、MyD88，MAVS和STING）的相互作用。免疫共沉淀實驗表明，帶有HA標記的ZNFX1與帶有Flag標記的MAVS相關，但與TRIF、MyD88和STING無關（圖6d）。免疫沉淀（Co-IP）實驗進一步表明，ZNFX1和MAVS在A549細胞中形成天然復合物，并且病毒感染后ZNFX1表達上調(diào)而增強了它們的結(jié)合（圖6e-g）。共聚焦顯微鏡實驗還表明ZNFX1與MAVS共定位（圖6h）。使用一系列ZNFX1截短突變體進行進一步的免疫沉淀試驗表明，全長ZNFX1和含ARM的突變體，包括F3和F5，都可以與MAVS相互作用（圖6i）。與共免疫沉淀試驗一致，ZNFX1的全長和F3截短突變體過表達導致了Ifnb1和ISG的誘導表達以及受限制的VSV復制（圖6j）。此外，如果沒有跨膜（TM）域，ZNFX1不能與截短的MAVS相互作用（圖6k），ZNFX1的線粒體分布與其與MAVS的相互作用無關。

 

圖6

7、ZNFX1介導的信號獨立于RIG-1和MDA5

為了驗證ZNFX1在產(chǎn)生獨立于現(xiàn)有抗病毒傳感器RIG-1和MDA5的抗病毒免疫反應中的作用，首先進行了共免疫沉淀試驗，發(fā)現(xiàn)ZNFX1在靜止或受VSV感染的細胞中既不與RIG-1也不與MDA5相互作用，qRT-PCR分析結(jié)果表明Znfx1缺乏并不影響RIG-1、MDA5和MAVS介導的Ifnb1表達的誘導（圖7a）。此外，過表達的ZNFX1可以強烈誘導野生型和Mda5-/-細胞中Ifnb1和Ifit1的mRNA表達，在Rig-I-/-細胞中略有誘導，但在Mavs-/-細胞中則沒有效果（圖7b）。當分別用ZNFX1、RIG-1和MDA5過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞時，Mda5-/-細胞中VSV和EMCV的病毒載量降低（圖7c）。同樣，F(xiàn)ACS分析表明，VSV-eGFP感染的野生型、Mda5-/-和Rig-I-/-細胞中的GFP+細胞百分比降低（7d,e）。通過進行poly(I:C)處理與否的Rig-I-/-A549細胞RNA-seq，觀察到ZNFX1的過表達增強了poly(I:C)刺激下Rig-I-/-A549細胞中IFN和ISG的誘導（圖7f）。分別用ZNFX1或RIG-I過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Znfx1和Rig-I雙敲除細胞（DKO）中VSV和poly(I:C)誘導的Ifnb1和Ifit1表達增強（圖7g,h）。此外，ZNFX1的siRNA敲低可以進一步增強Rig-I-/-細胞中VSV-eGFP的病毒載量（圖7i）。DKO細胞中VSVeGFP的病毒載量遠高于Rig-I-/-細胞中的病毒載量（圖7j）。所有這些結(jié)果表明ZNFX1無需依賴RLR(視黃酸誘導基因/RIG-1樣受體)即可發(fā)揮其抗病毒作用。

 

圖7

小結(jié)

總之，作者分析了先前發(fā)表的水皰性口炎病毒（VSV）感染的單核細胞衍生巨噬細胞（MDM）體外轉(zhuǎn)錄-多聚腺苷酸化位點測序（IVT-SAPAS）數(shù)據(jù)，確定ZNFX1（解旋酶SF1的成員）為ISG和線粒體定位的dsRNA傳感器。ZNFX1可以通過感測病毒RNA并與MAVS相互作用而在RNA病毒感染后立即啟動IFN和ISG表達，而無需依賴RLR(視黃酸誘導基因/RIG-1樣受體)。ZNFX1的鑒定不僅闡明了RNA解旋酶SF1在抗病毒免疫中的功能，而且為抗病毒治療提供了目標。

圖片文獻下載：

https://international.biocloud.net/zh/article/detail/31685995

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