snRNA-seq|靈長類動物心肺的單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜揭示新冠易感人群

導讀

研究背景：

年齡老化使我們更容易感染慢性病和微生物感染的傷害。常見的老年相關(guān)疾病如心血管病（CVD）和慢阻肺?。–OPD），是老年人死亡的第一大和第三大原因。2019年以來，新型冠狀病毒引發(fā)的肺部感染(COVID-19)席卷全球，給人們的生命健康造成嚴重威脅。目前，該病毒全球累計感染6554余萬人，其中死亡人數(shù)高達150多萬。據(jù)美國疾病預防控制中心統(tǒng)計，住院死亡病例中超過70%為年齡65歲以上的老年人。新冠患者多表現(xiàn)為呼吸急促、心血管功能受損等一系列癥狀。與年輕群體相比，老年群體對新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）更加易感，且更易發(fā)展為重癥、甚至死亡。但目前感染機制尚不清楚，所以我們迫切需要解決與高等哺乳動物衰老相關(guān)的細胞和分子機制。

方法與結(jié)果：

本文中，作者構(gòu)建了年輕和年老的非人類靈長類動物的肺、心臟和動脈的單細胞核轉(zhuǎn)錄組圖譜，這些是SARS-CoV-2靶向的主要組織。對細胞類型特異性衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄改變的分析顯示，全身炎癥增加和病毒防御受損是心肺衰老的標志。隨著年齡的增長，肺泡上皮屏障、心肌細胞和血管內(nèi)皮細胞中SARS-CoV-2受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2 (ACE2)的表達增加。我們發(fā)現(xiàn)白細胞介素7(IL7)在老年樣本的心肺組織富集，并以NF -κB依賴的方式誘導ACE2在人類血管內(nèi)皮細胞表達。此外，維生素C抑制了IL7誘導的ACE2表達。
結(jié)論：
作者描繪了年老的靈長類心肺系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄圖譜，并提供了關(guān)于年齡相關(guān)的SARS-CoV-2易感性的重要見解，這表示神經(jīng)保護策略可能降低老年人中COVID-19的嚴重程度。

材料與方法

作者以食蟹猴為研究對象，選取了4~6歲（相當于青壯年20歲）幼齡和18~21歲（相當于老年人79歲左右）的食蟹猴，通過單細胞核測序方法進行單細胞圖譜的繪制；
方法：RNA-seq，單細胞核轉(zhuǎn)錄組測序（snRNA-seq）等

實驗結(jié)果

分別對兩組樣品選取肺和心臟組織進行單細胞核測序（圖1a）。與幼齡猴肺相比，老年猴肺的特征是肺泡增大、纖維化增加和脂肪沉積（圖1b）。此外，在老年猴心臟中出現(xiàn)脂肪浸潤。同時，衰老的肺和心臟表現(xiàn)出較高水平的半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色，而這個是細胞衰老的特征（圖1c）。通過單細胞核測序，共獲得150000個細胞，利用UMAP聚類分析，鑒定了具有不同細胞特征的19中肺細胞和18中心臟細胞。利用已知細胞特征進行再次鑒定，在肺中，鑒定到了AT1和AT2、纖毛細胞（CCs）、內(nèi)皮細胞等，并鑒定出7中免疫細胞，包括AMs、IMs、B細胞、T細胞等（圖1d）。在心臟中，鑒定了肥厚性心肌細胞（H-CMs）、心外膜細胞、兩種神經(jīng)傳導細胞等，并鑒定出5種免疫細胞（圖1g）。通過GO數(shù)據(jù)庫注釋和轉(zhuǎn)錄組分析顯示，細胞類型在靈長類動物衰老過|中沒有明顯影響。研究顯示作者的數(shù)據(jù)代表了年輕和年老靈長類動物肺和心臟的單核細胞轉(zhuǎn)錄圖譜。

圖1

為了闡明細胞水平上與衰老相關(guān)的分子機制，作者在個性肺細胞中識別和衰老相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組變化。通過差異分析（| logFoldChange（logFC）| 0.25，調(diào)整后的P值<0.05）顯示，共獲得1356個差異基因（圖2a）。衰老過程中受影響最大的細胞包括AMs、T細胞、成纖維細胞、AT1和AT2，在老年和青年肺亞型中分別有372、262、239、235和217個差異基因。通過數(shù)據(jù)庫注釋，這些基因包含了肺部疾?。–OPD、肺炎、肺纖維化、哮喘等）的熱點基因。下調(diào)的DEGs參與上皮細胞增值、止血和表面活性物質(zhì)代謝（圖2c），提示衰老過程中肺功能受損。此外，SASP相關(guān)基因在10中類型細胞中過表達（圖2d），表明老年肺以細胞應激和慢性炎癥為特征。具體來說，上調(diào)的DEGs與囊泡介導的轉(zhuǎn)運有關(guān)（圖2c），這可能構(gòu)成病毒內(nèi)化的一個貢獻者。在蛋白水平上，通過免疫熒光分析證實了缺氧誘導的轉(zhuǎn)錄因子HIF1在老年肺中表達上調(diào)，提示老年肺可能發(fā)生明顯的缺氧應激反應，這可能是導致深度衰老的原因之一。通過上皮細胞和免疫細胞的轉(zhuǎn)錄特征分析，觀察到21個囊泡介導的轉(zhuǎn)運相關(guān)基因在AT2細胞中，這可能與病毒的進入、組裝等相關(guān)。因此，這些結(jié)果揭示了衰老可能導致肺泡上皮屏障功能衰退以及病毒防御能力受損。

圖2

總的來說，老年肺組織中許多免疫細胞類型的比例增加，包括肥大性細胞和漿細胞，他們分泌細胞因子和抗體導致年齡相關(guān)性炎癥、慢阻肺病和肺纖維化的比例增加。 為了探索衰老心臟中細胞特異性的分子機制，作者篩選出了1857個差異基因（|logFC| > 0.25, P value < 0.05）（圖3a），其中數(shù)十個基因是肥厚型心肌病的熱點基因（圖3b）。反映了心臟中與年齡相關(guān)的基因表達變化與老年人心臟病高發(fā)之間的緊密聯(lián)系。

通過對免疫細胞分析，在衰老的心臟中，免疫細胞和外周細胞的整體通信頻率增加，表明心臟免疫失調(diào)是心臟老化的一個重要特征。

圖3

為了識別可能被SARS-CoV-2靶向的細胞類型，作者分析了ACE2、TMPRSS2、FURIN和其他可能的輔助蛋白的細胞特異性的表達模式。在肺中，ACE2在AT2（7%）、AT1（1%）、纖毛細胞（3%）等類型中表達（圖4b-d），另外還發(fā)現(xiàn)，一小部分內(nèi)皮細胞表達ACE2、AECs、CECs均表達為0.2%，AT2和AT1中檢測到大多數(shù)ACE2和TMPRSS2雙陽性細胞。組織蛋白酶家族成員的FURIN、CTSB、CTSL等膜錨定蛋白酶與ACE2共表達。這些數(shù)據(jù)確認AT2和AT1是肺中COVID-19的易感細胞類型。有趣的是，衰老細胞中ACE2陽性的AT1細胞比例增加了約2倍。更重要的是，衰老過程中，NHP和人肺部的免疫染色均證實了肺泡周圍ACE2陽性細胞的增加，提示隨著年齡的增長，肺泡表面更容易感染SARS-CoV-2的細胞比例增加。

圖4

最后，作者試圖探索哪些與衰老相關(guān)的因素可能介導靈長類組織中ACE2的上調(diào)、因為大量RNA-seq分析顯示，IL7不僅在老年人肺部、心臟和主動脈普遍上調(diào)，同時，也是導致COVID-19患者免疫過度反應的細胞因子之一。研究發(fā)現(xiàn)，IL7的刺激在測試的時間內(nèi)上調(diào)了ACE2的表達，在藥物治療后兩天達到了最高的記錄。另外，IL7對HAECs的處理通過Western blot分析顯著上調(diào)了ACE2的表達水平。因此，這些結(jié)果表明，IL7在靈長類動物衰老期間，至少在HAEC中，在上調(diào)ACE2表達中起關(guān)鍵作用。而維生素C的預處理會使HAEC中IL7誘導的ACE2表達減弱。

總結(jié)

在這項研究中，研究人員分析了老年靈長類動物呼吸道和心血管組織的單核轉(zhuǎn)錄組圖譜，以了解其易受年齡相關(guān)疾病和COVID-19侵害的細胞和分子基礎(chǔ)。發(fā)現(xiàn)靈長類動物肺部和心血管衰老的關(guān)鍵特征包括受損的組織穩(wěn)態(tài)和病毒防御能力以及激活炎癥反應。提出將抗神經(jīng)保護劑重新用于COVID-19治療，尤其是對于弱勢老年患者，可能是預防和治療策略之一。另外阻斷IL7信號傳導可能有助于降低全身或局部ACE2水平并緩解SARS-CoV-2癥狀。