【項(xiàng)目案例】群體研究——BSA、遺傳圖譜應(yīng)用案例

利用基因組重測(cè)序技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模高通量SNP標(biāo)記鑒定是當(dāng)前國(guó)際上動(dòng)植物基因組學(xué)的研究熱點(diǎn)。利用得到的大量SNP標(biāo)記，可以對(duì)群體進(jìn)行高密度遺傳圖譜、BSA、GWAS、遺傳進(jìn)化等分析。百邁客在群體研究領(lǐng)域又有哪些應(yīng)用呢？下面和小編一起學(xué)習(xí)一下遺傳圖譜和BSA的項(xiàng)目案例。

遺傳圖譜

遺傳圖譜（Genetic map），是基于全基因組重測(cè)序技術(shù)或簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)，對(duì)某物種家系樣本進(jìn)行測(cè)序，利用生物信息學(xué)方法，開發(fā)SNP分子標(biāo)記，計(jì)算標(biāo)記間的遺傳連鎖距離，繪制高密度遺傳圖譜。利用遺傳圖譜，主要可以進(jìn)行QTL定位，比較基因組，輔助基因組組裝等科研工作。本研究報(bào)道了利用百邁客SLAF測(cè)序技術(shù)，對(duì)菊花F1群體測(cè)序并構(gòu)建高密度遺傳圖譜，用于菊花花型等性狀的QTL定位及候選基因鑒定的研究。

菊花 (Chrysanthemum×morifolium Ramat.) 作為重要的觀賞性植物，花型對(duì)于它至關(guān)重要。舌狀花花冠筒基部合生程度（CTMD）和舌狀花相對(duì)數(shù)量（RNRF）是影響花型的兩個(gè)關(guān)鍵性狀，但由于這兩個(gè)性狀構(gòu)成要素相對(duì)復(fù)雜，其遺傳機(jī)制還未被揭示，進(jìn)而限制了菊花花型改良的定向育種。
本研究對(duì)CTMD和RNRF差異較大的菊花‘Candy’和菊花‘225’親本以及305個(gè)F1代雜交群體進(jìn)行了SLAF-seq簡(jiǎn)化基因組測(cè)序，測(cè)序深度分別為57.48X，59.69X和23.52X，通過(guò)分析鑒定得到了234,648個(gè)高質(zhì)量SNPs，利用高質(zhì)量的SNPs構(gòu)建了一套總圖距為4301.5cM、平均圖距為0.76cM的菊花高密度遺傳圖譜，為菊花花型遺傳育種研究提供了豐富的遺傳標(biāo)記。

圖1 雙親的花型表現(xiàn)

圖2 菊花高密度遺傳圖譜

基于這一圖譜，結(jié)合連續(xù)兩年的表型數(shù)據(jù)，對(duì)9個(gè)菊花花型性狀進(jìn)行了QTL分析，定位到123個(gè)相關(guān)QTLs位點(diǎn)；控制CTMD的QTLs有16個(gè)（圖3），其中有3個(gè)為主效QTLs，LOD值分別為3.77，5.09和5.23（圖4）；控制RNRF的QTLs有34個(gè)（圖5），其中有4個(gè)為主效QTLs。LOD值分別為4.11，4.74，4.96和5.22（圖6）。

圖3 CTMD性狀的QTL定位結(jié)果

圖4 CTMD性狀的主效QTL定位結(jié)果

圖5 RNRF性狀的QTL定位結(jié)果

圖6 RNRF性狀的主效QTL定位結(jié)果

為了進(jìn)一步發(fā)掘潛在的候選基因，將菊花遺傳圖譜與已發(fā)表的近緣物種向日葵和生菜的基因組進(jìn)行共線性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菊花遺傳圖譜上有150個(gè)SNPs標(biāo)記可以比對(duì)到向日葵基因組，0.12%的SNPs標(biāo)記可以比對(duì)到生菜基因組；依據(jù)基因組注釋信息，檢測(cè)得到向日葵基因組中有8個(gè)候選基因與CTMD和RNRF相關(guān)，生菜基因組中有20個(gè)候選基因與CTMD和RNRF相關(guān)。利用同樣的方法，對(duì)甘野菊（C. seticuspe）的參考基因組和兩個(gè)野生菊花，毛華菊（C. vestitum）和甘菊（C. lavandulifolium） 的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)做了分析，得到了一些與CTMD和RNRF性狀相關(guān)的候選基因。
本研究通過(guò)構(gòu)建菊花高密度遺傳圖譜，為菊花高密度遺傳定位和與花型性狀相關(guān)的QTL鑒定提供了有用的基準(zhǔn)信息，為進(jìn)一步闡明菊花花型遺傳機(jī)理提供了新見解，同時(shí)也有利于加速菊花花型的定向改良育種。

Bulked Segregant Analysis (BSA)

BSA（Bulk Segregant Analysis）分析是利用極端性狀個(gè)體混池快速進(jìn)行功能基因挖掘的常用方法，廣泛應(yīng)用在植物基因克隆方面。利用該方法，可以快速的對(duì)單一性狀進(jìn)行精細(xì)定位，加速目標(biāo)性狀的功能基因組研究進(jìn)程。本研究利用百邁客SLAF-BSA-seq技術(shù)，結(jié)合親本重測(cè)序，對(duì)番茄柱頭外露基因進(jìn)行基因定位，并對(duì)定位基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。

番茄（Solanum lycopersicum）作為自花授粉作物，有著超然的雜種優(yōu)勢(shì)，其雜交品種產(chǎn)量高，抗性好，因此番茄在生產(chǎn)上多采用雜交種。目前，在研究番茄雜交育種過(guò)程中，利用雄性不育系協(xié)助雜交種子的生產(chǎn)成為了新趨勢(shì)。本研究主要從形態(tài)、生理及基因定位三個(gè)方面進(jìn)行研究。
本研究利用石蠟切片法對(duì)其結(jié)構(gòu)變化及不育原因進(jìn)行觀察，觀察不育材料T431（圖1E）與對(duì)照材料（圖1B）成熟花柱的橫切，可以看出不育材料T431花柱中的維管束數(shù)目多于對(duì)照材料。同時(shí)形態(tài)觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)不育材料花柱直徑顯著大于對(duì)照材料，維管束數(shù)目的增多可能直接導(dǎo)致了不育材料花柱直徑變大（圖1C, D, F, G）。觀察成熟花柱的細(xì)胞發(fā)現(xiàn)不育材料與對(duì)照材料花柱細(xì)胞大小沒有顯著差別。因此說(shuō)明不育材料花柱伸長(zhǎng)是由花柱細(xì)胞數(shù)目增多導(dǎo)致而非細(xì)胞體積變大導(dǎo)致。

圖1 花柱解剖結(jié)構(gòu)圖

采用高效液相色譜法對(duì)花柱中不同時(shí)期的五種激素含量的變化進(jìn)行了分析，從整體含量變化來(lái)看，不育材料T431中IAA的增長(zhǎng)率達(dá)到了176.6%，而對(duì)照材料中IAA的增長(zhǎng)率僅為25.6%，說(shuō)明不育品種中花柱維管束數(shù)目增多可能是由于IAA水平的升高導(dǎo)致（圖2 A）；GA3含量整體變化趨勢(shì)一致，GA3含量在不育材料T431中均高于對(duì)照材料（圖2B）；在花發(fā)育前期可育材料中ZT含量高于不育材料T431，后期出現(xiàn)波動(dòng)（圖2C）；ABA含量在對(duì)照材料中從整體上來(lái)看呈穩(wěn)步上升趨勢(shì)，而不育材料T431中則較為平穩(wěn)，并沒有明顯的變化（圖2D）；不育材料T431中SA含量在花不同發(fā)育時(shí)期的變化趨勢(shì)與對(duì)照材料呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)（圖2E）。結(jié)果表明不育材料T431中GA3水平的提升，IAA和ZT含量的積累，ABA與水楊酸的不同變化趨勢(shì)以及這5種激素間的相互作用均對(duì)花柱的伸長(zhǎng)產(chǎn)生了影響，導(dǎo)致不育的發(fā)生。

圖2 T431（不育材料）和DL5（對(duì)照材料）中不同激素在不同時(shí)期的變化趨勢(shì)
1-4分別表不花蕾長(zhǎng)度0.5 cm．0.7 cm，0.9 cm，1.1 cm；5-8分別表示花瓣開張角30°，45°，60°，90°。

作者利用親本重測(cè)序技術(shù)與Super-SLAF-BSA-seq的方法相結(jié)合來(lái)對(duì)番茄部位不育基因進(jìn)行定位。以番茄位置不育型雄性不育材料T431為父本，可育材料DL5為母本進(jìn)行雜交，得到F1代，再將F1代自交獲得F2代分離群體，在F2代中選取50株不育株和50株可育株，構(gòu)建可育池和不可育池，提取父本和母本的DNA，構(gòu)建父本池和母本池，最終得到4個(gè)混池；分析發(fā)現(xiàn)兩個(gè)子代混池樣本間共有154,756個(gè)SLAF標(biāo)簽，使用BWA軟件將SLAF標(biāo)簽定位到番茄基因組上，對(duì)不同染色體上的SLAF標(biāo)簽和多態(tài)性SLAF標(biāo)簽的數(shù)目進(jìn)行匯總（圖3）,通過(guò)SNP的檢測(cè)和過(guò)濾，最終得到9,411個(gè)高質(zhì)量的可信SNP位點(diǎn)。

圖3 SLAF標(biāo)簽分布圖（A）和多態(tài)性SLAF標(biāo)簽分布圖（B）

接著利用混池間差異SNP的深度差異，使用ED算法來(lái)分析計(jì)算與目的基因相連鎖的區(qū)域，結(jié)果顯示12號(hào)染色體上存在兩個(gè)較大且較明顯的區(qū)域，這兩個(gè)區(qū)域的大小分別為1.75 Mbp和3.15 Mbp，作者最終確定這兩個(gè)區(qū)域與目標(biāo)基因相連鎖，并將其選為候選區(qū)域（圖4）；利用百邁客云平臺(tái)分析，在番茄12號(hào)染色體上的兩個(gè)候選區(qū)域內(nèi)共找到26個(gè)候選基因，通過(guò)GO、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，最終將Solyc12g027610.1確定為本研究的候選基因；對(duì)該基因功能進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，Solyc12g027610.1參與了細(xì)胞分裂素的代謝過(guò)程，且與多種激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。另外，Solyc12g027610.1作為一個(gè)乙烯受體蛋白，與番茄乙烯受體基因SlETR以及擬南芥中編碼蛋白AtEIN4的乙烯基因高度同源。

圖4 兩個(gè)混池的BSA分析結(jié)果

最后，作者對(duì)番茄SILst基因進(jìn)行基因功能驗(yàn)證及亞細(xì)胞定位；亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，基因SlLst于細(xì)胞核和細(xì)胞膜中均有分布；通過(guò)對(duì)基因SlLst過(guò)表達(dá)番茄的表型分析進(jìn)行基因功能驗(yàn)證，表明基因SlLst在柱頭外露過(guò)程中起重要作用。
本研究分析了番茄外露柱頭的形態(tài)變化和激素作用，結(jié)合親本重測(cè)序和SLAF-BSA-seq，快速定位到番茄外露柱頭候選基因SlLst，并對(duì)基因SlLst進(jìn)行了功能分析，為基因克隆及分子標(biāo)記輔助育種提供一條強(qiáng)有力的途徑。

好消息

目前百邁客云平臺(tái)已經(jīng)把全基因組重測(cè)序分析、BSA分析、GWAS、遺傳進(jìn)化分析四種測(cè)序分析技術(shù)實(shí)現(xiàn)了云交付。百邁客云分析平臺(tái)整合了目前最主流的分析流程，結(jié)果準(zhǔn)確有保證，分析過(guò)程簡(jiǎn)單易上手，從數(shù)據(jù)上傳到參數(shù)設(shè)置，再到基因組選擇，只需簡(jiǎn)單幾步就可以完成項(xiàng)目數(shù)據(jù)的投遞和分析；結(jié)題報(bào)告云交付，分析完成即可拿到項(xiàng)目結(jié)果。詳情咨詢當(dāng)?shù)劁N售！

參考文獻(xiàn)

[1] Song XB, Xu YH, Gao K, et al. High-density genetic map construction and identification of loci controlling flower-type traits in Chrysanthemum (Chrysanthemum × morifoliumRamat.). Hortic Res, 2020.07

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