沒有異戊烷怎么做空間轉(zhuǎn)錄組？

各位有做空間轉(zhuǎn)錄組想法的伙伴們，還在為買不到易燃易爆的異戊烷犯難嗎？還在為異戊烷純度不夠煩惱嗎？還在為解決不了異戊烷的問題實(shí)驗(yàn)停滯不前嗎？今天，百邁客跟大家分享幾種空間轉(zhuǎn)錄組組織包埋的方法，沒有異戊烷也可以冷凍組織喲~

 

組織不應(yīng)直接置于液氮中，因?yàn)闇囟炔羁赡軙?dǎo)致組織表面沸騰，從而導(dǎo)致氣穴和不均勻的冷凍這可能會破裂并在形態(tài)上破壞組織。如果您有異戊烷且純度足夠高的話，還是推薦您用異戊烷進(jìn)行組織冷凍的，具體方法如下：

a.用異戊烷（足以完全浸沒組織）填充三分之二的金屬燒杯，然后放入液氮杜瓦瓶中（與異戊烷相同的高度）以充分接觸，孵育 15 分鐘。

b.將新鮮組織置于培養(yǎng)皿中，用干凈的紗布或者紙巾吸干組織周圍血水，盡量使組織表明干燥。

c.標(biāo)記冷凍模具以標(biāo)記組織的方向，用預(yù)冷的 OCT 填充模具，避免產(chǎn)生氣泡。

d.用鑷子將組織放入含預(yù)冷OCT的模具中，用OCT 覆蓋任何裸露組織的表面，確認(rèn)沒有氣泡，尤其是在組織附近。

e.用鑷子將模具放到異戊烷中，但不要使異戊烷浸入模具內(nèi)，直到組織凍結(jié)。冷凍時間可根據(jù)組織類型和大小而變化。

f.冷凍后，將組織轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的冷凍管中，然后放在干冰上。

g.將 OCT 包埋的組織塊保存在–80℃的密封容器中，以便長期保存，或立即進(jìn)行冷凍切片

 

如果您的新鮮樣本打算直接進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)，且實(shí)驗(yàn)室沒有異戊烷的話百邁客在這里給您推薦直接用干冰粉進(jìn)行組織冷凍包埋，具體方法如下：

a.直接準(zhǔn)備干冰粉或用研缽將干冰塊研磨成粉

b.將新鮮組織置于培養(yǎng)皿中，用干凈的紗布或者紙巾吸干組織周圍血水，盡量使組織表明干燥。

c.標(biāo)記冷凍模具以標(biāo)記組織的方向，用預(yù)冷的 OCT 填充模具，避免產(chǎn)生氣泡

d.用鑷子將組織放入含預(yù)冷OCT的模具中，用OCT 覆蓋任何裸露組織的表面，確認(rèn)沒有氣泡，尤其是在組織附近。

e.將組織放入干冰粉中，直到組織凍結(jié)。此方法冷凍包埋組織較慢，且須在干冰粉上靜置一段時間，確保組織冷凍均勻，約需30分鐘。

f.冷凍后，將組織轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的冷凍管中，然后放在干冰上。

g.將 OCT 包埋的組織塊保存在–80℃的密封容器中，以便長期保存，或立即進(jìn)行冷凍切片。

 

組織冷凍包埋組織的方法就給大家介紹到這里，下面跟大家分享一篇結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)探討小膠質(zhì)細(xì)胞與腦外傷關(guān)系的文章。

 

空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)輔助揭示再生小膠質(zhì)細(xì)胞

依賴白介素-6促進(jìn)大腦修復(fù)的機(jī)制

英文題目：Repopulating Microglia Promote Brain Repair in an?IL-6-Dependent Manner

中文題目：再生小膠質(zhì)細(xì)胞依賴白介素-6促進(jìn)大腦修復(fù)

發(fā)表雜志：cell

影響因子：38.637

 

研究方法

材料：小鼠大腦

方法：通過藥理學(xué)或遺傳方法誘導(dǎo)小鼠大腦中小膠質(zhì)細(xì)胞的更替，結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)闡述小膠質(zhì)細(xì)胞具有促進(jìn)修復(fù)和減輕腦損傷引起的認(rèn)知缺陷的功能。

 

研究背景

小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中最豐富的免疫細(xì)胞，在大腦發(fā)育、維持和疾病中發(fā)揮重要作用。這類細(xì)胞雖與外周巨噬細(xì)胞親緣性不高，但在發(fā)育早期就存在于大腦中，并通過促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的形成、突觸連接和凋亡細(xì)胞的去除，來促進(jìn)神經(jīng)回路的塑造。小膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為在成年大腦中起著類似的生理作用，它們還能對影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性疾病和急性損傷做出強(qiáng)烈反應(yīng)，由于小膠質(zhì)細(xì)胞與單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞有許多共同的表型特征，因此闡明它們對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病的作用具有重要意義。然而，小膠質(zhì)細(xì)胞不僅被報道在健康成年大腦中介導(dǎo)學(xué)習(xí)相關(guān)的突觸可塑性，而且還在神經(jīng)炎癥和正常老化過程中的病理和認(rèn)知功能障礙等方面起著關(guān)鍵作用。

具有廣泛小膠質(zhì)細(xì)胞活化的慢性非溶解性炎癥是外傷性腦損傷的一個重要特征，本文利用這一特性直接探索小膠質(zhì)細(xì)胞在影響神經(jīng)退行性變和認(rèn)知功能方面的假定作用。在急性期，已知小膠質(zhì)細(xì)胞對腦損傷釋放的損傷相關(guān)分子模式作出快速反應(yīng)，然后以ATP依賴的方式向損傷部位遷移,清除細(xì)胞碎片被認(rèn)為是早期小膠質(zhì)細(xì)胞活化的有利方面，這是傷口愈合過程的關(guān)鍵部分。另一方面，在炎癥基因表達(dá)和/或吞噬現(xiàn)象出現(xiàn)時，許多腦小膠質(zhì)細(xì)胞在創(chuàng)傷性腦損傷的慢性階段仍保留激活狀態(tài)，盡管直接證據(jù)不足，這種持續(xù)的激活狀態(tài)通常被認(rèn)為是有害的。

總的來說，關(guān)于小膠質(zhì)細(xì)胞與腦外傷的關(guān)系，仍有很大的不確定性。作為繼發(fā)性炎癥病理的驅(qū)動因素，它們是否確實(shí)惡化了神經(jīng)系統(tǒng)的預(yù)后?它們是否妨礙或支持內(nèi)源性修復(fù)過程，或者可能在損傷過程的不同時間階段都存在所有類型的過程?本文將通過一個外傷性腦損傷小鼠模型給出以上問題的答案。

 

研究結(jié)果

1.?外傷性腦損傷后，消除小膠質(zhì)細(xì)胞并不能提高認(rèn)知能力，也不能刺激神經(jīng)形成

首先通過喂食小鼠集落刺激因子-1受體（CSF-1R）拮抗劑PLX5622 ，使小膠質(zhì)細(xì)胞衰竭，來檢查外傷性腦損傷（TBI）后小膠質(zhì)細(xì)胞缺失是否會改變海馬依賴任務(wù)中的認(rèn)知結(jié)果。用可控皮質(zhì)撞擊造成TBI,在腦外傷前3周開始持續(xù)給藥PLX5622，可導(dǎo)致大范圍的Iba1^pos?、TMEM119^pos細(xì)胞的丟失，包括海馬區(qū)。在腦外傷后的整個實(shí)驗(yàn)時間內(nèi)，海馬區(qū)保持95%的功能缺失。這些結(jié)果與喂食食物的小鼠對照組形成鮮明對比。在腦外傷后的12天內(nèi)，海馬內(nèi)的Iba1^pos細(xì)胞數(shù)量是假手術(shù)組的5倍。

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圖1A.?腦外傷后Iba1^pos小膠質(zhì)細(xì)胞的定量研究圖

圖1B.plx5622處理小鼠術(shù)后12天海馬內(nèi)Iba1^pos和TMEM119^pos小膠質(zhì)細(xì)胞(綠色)的丟失

 

 

在證實(shí)持續(xù)使用PLX5622治療可有效清除腦小膠質(zhì)細(xì)胞后，接下來測試了三種依賴海馬功能的行為模式下實(shí)驗(yàn)小鼠的認(rèn)知能力，主要測試實(shí)驗(yàn)：活動場所回避(APA)，是一個具有挑戰(zhàn)性的空間學(xué)習(xí)任務(wù)，動物被放置在一個旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)盤上，并要求通過視覺線索不斷改變他們的位置以避免被移動到一個靜止的打擊區(qū)。結(jié)果表明在plx5622處理過的小鼠中并沒有顯著改變運(yùn)動行為，而無論是否存在小膠質(zhì)細(xì)胞，假手術(shù)小鼠很快就學(xué)會了避開打擊區(qū)，因此，在假手術(shù)和非假手術(shù)條件下，小膠質(zhì)細(xì)胞的藥物清除并不影響空間學(xué)習(xí)結(jié)果。在Morris水迷宮和y迷宮任務(wù)中也證實(shí)了這些結(jié)果。

 

2.?創(chuàng)傷性腦損傷后，小膠質(zhì)細(xì)胞的再生減弱了空間學(xué)習(xí)障礙

文章通過兩種獨(dú)立且互補(bǔ)的方法驗(yàn)證了這一點(diǎn)，首先，使用遺傳模型鼠，小膠質(zhì)細(xì)胞可通過白喉毒素(DT)選擇性去除，然后再生（圖2）；其次，使用已建立的藥理學(xué)方法，但用短期而不是持續(xù)的PLX5622治療來誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的更替；對照組小鼠只服用玉米油。結(jié)果表明在創(chuàng)傷性腦損傷急性期誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞再生的遺傳學(xué)和藥理學(xué)方法都顯著改善了活動場所回避（APA）的學(xué)習(xí)缺陷

圖2A.遺傳模型鼠在停止注射DT和TBI后 小膠質(zhì)細(xì)胞（紅色）的再生

圖2B . DT與TBI處理后小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目比較灰色線為對照組

3.?創(chuàng)傷性腦損傷后，再生小膠質(zhì)細(xì)胞刺激功能神經(jīng)再生

與同齡假手術(shù)對照組相比，TBI本身可使遺傳模型小鼠的同側(cè)海馬內(nèi)DCX^pos細(xì)胞總數(shù)減少＞60%。然而令人驚訝的是，遭受TBI12天后，在遺傳模型鼠小膠質(zhì)細(xì)胞再生過程中未成熟DCX^pos神經(jīng)元的總數(shù)增加了~2倍（圖3C），用溴脫氧尿苷（BrdU）進(jìn)行的脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示了損傷后新生神經(jīng)元數(shù)量的大量增加，并在小膠質(zhì)細(xì)胞再生的TBI小鼠中存活至第12天（圖3D），同時也觀察到了海馬Tbr2^pos神經(jīng)元前體的增加和活性，在TBI急性期采用藥理學(xué)方法誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞更新時，DCX^pos細(xì)胞數(shù)量也有類似的增加，在這些條件下也觀察到更多的Tbr2^pos神經(jīng)元前體細(xì)胞的存在（圖3E）和活性（圖3F）。為了完全排除外周效應(yīng)和/或脫靶效應(yīng)，直接向模型小鼠海馬中注射DT，僅在局部誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的再生，再次觀察到TBI后小膠質(zhì)細(xì)胞耗竭和再生刺激神經(jīng)再生。

研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)歷過小膠質(zhì)細(xì)胞耗竭和再生的小鼠的大腦海馬組織體積更大（圖3G-I）。

值得注意是，小膠質(zhì)細(xì)胞耗竭和再生對神經(jīng)再生的促進(jìn)作用被限制在一個狹窄的時間窗內(nèi)，即損傷后3天內(nèi)，小膠質(zhì)細(xì)胞在此段時間后的更替并不支持新生神經(jīng)元的產(chǎn)生和生存能力的增強(qiáng)。

圖3C.損傷后12天未成熟 DCX^pos神經(jīng)元總數(shù)的定量

圖3D.損傷后12天TBI后新生未成熟 DCX^posBrdU^pos神經(jīng)元的定量研究

圖3E.損傷后12天中間Tbr2^pos神經(jīng)元前體細(xì)胞的定量

圖3F.損傷后12天增殖中間神經(jīng)元祖細(xì)胞(Tbr2^posEdU^pos)的定量

 

?圖3 .對照組（G）和plx5622處理后（H）12天的小鼠海馬背側(cè)體積

 

4.?小膠質(zhì)細(xì)胞再生的神經(jīng)保護(hù)作用依賴IL-6傳遞信號

在確定了TBI急性期活躍的小膠質(zhì)細(xì)胞再生能刺激功能神經(jīng)發(fā)生后，接下來探索了介導(dǎo)這些效應(yīng)的可能的信號通路。進(jìn)一步探索全海馬組織勻漿中與IL-6信號相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)IL6Ra、IL-6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子(IL6st，也稱為gp130 [IL6st/gp130])、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3 (STAT3)的表達(dá)量均隨小膠質(zhì)細(xì)胞的再生而增加，本文首先證實(shí)再生小膠質(zhì)細(xì)胞確實(shí)是增加IL-6表達(dá)的關(guān)鍵因素，然后，確定了存在再生小膠質(zhì)細(xì)胞的條件下，海馬顆粒細(xì)胞是腦外傷后的主要白介素-6來源（圖4）。

 

?圖4 .TBI遺傳模型小鼠中IL-6的細(xì)胞來源及正在進(jìn)行再生的小膠質(zhì)細(xì)胞

 

5.?小膠質(zhì)細(xì)胞的再生具有獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄特征，可以調(diào)節(jié)腦外傷后的微環(huán)境

比較原始和再生小膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組時發(fā)現(xiàn)大量差異表達(dá)的基因，再生的小神經(jīng)膠質(zhì)對編碼在傷口愈合和修復(fù)中有已知作用的蛋白質(zhì)的基因表現(xiàn)出更高表達(dá)量（例如, Emilin2, Fn1, Alcam, andCspg4），獨(dú)創(chuàng)性通路分析(IPA)進(jìn)一步揭示了涉及模式/損傷識別和干擾素信號的典型通路的活性降低(圖5A)，此外還反映了再生小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖狀態(tài)。主要的變化是再生細(xì)胞的反應(yīng)性降低和增殖能力增強(qiáng)，這是受損大腦中再生小膠質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá)譜與原小膠質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá)譜的本質(zhì)區(qū)別，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了小膠質(zhì)細(xì)胞再生對其局部微環(huán)境的影響，具體來說，與星形膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)毒性和/或神經(jīng)炎癥(A1)表型相關(guān)的基因受到抑制，在蛋白水平上，通過將這些細(xì)胞與A1標(biāo)記物C3聯(lián)合染色而得到證實(shí)（圖5B）。

圖5A.基于差異基因表達(dá)的12個經(jīng)典通路的分析圖

 

 

?圖5B.星形膠質(zhì)細(xì)胞C3染色(A1標(biāo)記)的平均熒光強(qiáng)度

 

結(jié)論

在受到損傷影響的大腦區(qū)域中，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞的存在不一定對結(jié)果和/或認(rèn)知功能障礙有負(fù)面影響，相反，在受損傷后的大腦中，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞似乎大多缺乏支持內(nèi)源性修復(fù)過程的能力。然而，在哺乳動物的大腦中和再生生物體如蠑螈和斑馬魚，可以誘導(dǎo)出一種可再生的小膠質(zhì)細(xì)胞表型，炎癥信號在其中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。本文已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了IL-6信號通路與這種有益表型相關(guān)的關(guān)鍵作用，未來的研究可以進(jìn)一步確定如何利用小膠質(zhì)細(xì)胞再生的獨(dú)特表型特征進(jìn)行治療。