BSA（bulked segregant analysis）又叫集群分離分析法，該方法主要是選擇雙親群體分離后代中具有極端表型的個(gè)體進(jìn)行混樣，通過比較不同極端混樣池之間的多態(tài)性標(biāo)記的差異，從而篩選出與性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的定位。BSA分析早期使用的都是傳統(tǒng)分子標(biāo)記，根據(jù)標(biāo)記與性狀共分離（緊密連鎖）得到定位區(qū)間，不過由于其標(biāo)記密度低、定位精度差、實(shí)驗(yàn)操作繁瑣已經(jīng)逐漸不再使用。近年來，BSA方法和高通量測序相結(jié)合，通過比較不同混池間SNP的頻率差異或者比較混池間純合SNP的密度的差異，實(shí)現(xiàn)基因的定位，高通量測序方式以其簡單、快速、準(zhǔn)確、高性價(jià)比的特點(diǎn)受到科研工作者的青睞。那么，對于不了解BSA的研究者來說，如何快速了解BSA的發(fā)展歷程、原理方法、應(yīng)用領(lǐng)域，如何快速上手BSA分析，今天大師兄為大家推薦幾篇BSA代表性文章，讓你輕松搞定BSA，趕緊上車。
BSA的提出
文章題目：Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: A rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations
發(fā)表期刊：PNAS
發(fā)表年份：1991
文章要點(diǎn)：
（1）在這篇文章中BSA方法被首次提出來，是BSA的開山鼻祖。
（2）該文章利用傳統(tǒng)的RAPD標(biāo)記，首先通過篩選親本間多態(tài)標(biāo)記，然后在性狀分離的雜交群體中選擇性狀極端個(gè)體組成混池，根據(jù)多態(tài)標(biāo)記與混池性狀共分離的原理，獲得與性狀連鎖的markers。
（3）利用該方法，作者對萵苣霜霉病抗性基因進(jìn)行的了定位。
?圖1?BSA方法篩選共分離標(biāo)記
BSA的進(jìn)階
1、文章題目：Genome sequencing reveals agronomically important loci in rice using MutMap
發(fā)表期刊：Nature Biotechnology
（1）該文章提出了一種針對化學(xué)誘變劑的點(diǎn)突變性狀的定位方法—mutmap，該方法是目前在做植物誘變性狀研究的主要方法。
（2）該方法使用突變個(gè)體與其野生型個(gè)性進(jìn)行雜交得到F2群體，在群體中選擇突變表型的子代組成1個(gè)突變混池，然后只對混池DNA進(jìn)行高通量測序。
（3）該方法中首次提出了SNP-index的概念，SNP-index是目前最常用的BSA定位方法之一，即計(jì)算混池中非參考基因組類型的SNP的頻率，同時(shí)再利用滑窗法對連續(xù)多個(gè)SNP的SNP-index值進(jìn)行擬合，最終獲得性狀關(guān)聯(lián)的基因組區(qū)間。
（4）作者利用該方法對水稻夜色突變基因進(jìn)行了定位，并且在chr12的尾部定位一個(gè)候選基因OsCAO1。
圖2?mutmap定位原理示意圖
2、文章題目：MMAPPR: Mutation Mapping Analysis Pipeline for Pooled RNA-seq
（1）該文章首次提出了MMAPPR的方法對突變性狀進(jìn)行基因定位，該方法最大的亮點(diǎn)是對極端個(gè)體混池的RNA進(jìn)行測序，而不再是混池的DNA進(jìn)行重測序，這對于基因組較大的物種來說無疑不是一種最佳選擇。
（2）對于沒有親本的雜交子代群體，首次將歐式距離算法（Euclidean distance，ED）應(yīng)用到性狀關(guān)聯(lián)分析中，同時(shí)提出通過ED值乘冪的方式實(shí)現(xiàn)背景噪音的過濾。
（3）在性狀關(guān)聯(lián)時(shí)，使用了LOESS擬合的方法對ED乘冪值進(jìn)行擬合，獲得顯著關(guān)聯(lián)的基因組區(qū)間。
（4）利用該方法，作者對斑馬魚心血管突變體性狀進(jìn)行了分析，最終定位到2個(gè)候選基因ctr9和cds2。
圖3?MMAPPR的定位過程
3、文章題目：MutMap+: Genetic Mapping and Mutant Identification without Crossing in Rice
（1）該文章是對突變性狀定位的一種延伸，也是對mutmap方法的一個(gè)補(bǔ)充，主要區(qū)別是如果隱形突變個(gè)體無法正常發(fā)育在幼苗期出現(xiàn)死亡，因此無法與野生親本雜交構(gòu)建分離群體，所以該方法巧妙的選擇了突變位點(diǎn)雜合的個(gè)體進(jìn)行自交，從而在自交M3或者M(jìn)4選擇極端個(gè)體構(gòu)建混池進(jìn)行后續(xù)分析。
（2）該方法為了避免SNP在自交過程中的固定效應(yīng)和群體中的偏分離標(biāo)記，不再像mutnap分析中對一個(gè)突變性狀混池進(jìn)行測序，而是對2個(gè)極端混池都進(jìn)行測序，從而降低了背景噪音。
（3）在SNP-index關(guān)聯(lián)算法的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)展提出△SNP-index算法，通過△SNP-index的大小判斷性狀關(guān)聯(lián)區(qū)域。
（4）利用該方法對水稻淺綠葉色突變進(jìn)行了分析，定位并驗(yàn)證了OsNAP6基因的功能。
?圖4 MutMap+的定位過程
4、文章題目：QTL-seq: rapid mapping of quantitative trait loci in rice by whole genome resequencing of DNA from two bulked populations
發(fā)表期刊：The Plant Journal
（1）前期的BSA定位方法主要集中在發(fā)生突變的質(zhì)量性狀上，該文章提出了針對植物數(shù)量性狀的研究方法QTL-seq。如果一個(gè)性狀是由多基因調(diào)控，分離群體子代的性狀呈現(xiàn)正態(tài)分布，QTL-seq方法選擇極端表型的部分子代構(gòu)建混池并進(jìn)行高通量測序，該方法是目前數(shù)量性狀定位的主流方法。
（2）對于SNP-index關(guān)聯(lián)值提出了置信區(qū)間的算法，將定位結(jié)果鎖定在基因組某個(gè)區(qū)間范圍內(nèi)。
（3）利用該方法作者對水稻稻瘟病菌抗性進(jìn)行了定位，并且在chr6頭部定位到一個(gè)顯著的關(guān)聯(lián)峰。
?圖5 QTL-seq的定位過程
BSA的升級
1、文章題目：QTG-Seq Accelerates QTL Fine Mapping through QTL Partitioning and Whole-Genome Sequencing of Bulked Segregant Samples
（1）該方法是整合了遺傳圖譜QTL定位、回交子代背景選擇、QTL-seq于一體的綜合方案，項(xiàng)目開展前需要經(jīng)過精心的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，該方法可以實(shí)現(xiàn)數(shù)量性狀或者質(zhì)量性狀調(diào)控基因的精細(xì)定位，并且可以對某個(gè)性狀的多個(gè)主效位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行定位。
（2）首先通過F2代遺傳圖譜進(jìn)行初步定位，獲得某個(gè)性狀所有QTL信息，然后從BC1F1中篩選目標(biāo)QTL雜合，其它背景QTL純合的單株，自交一代得到BC2F1，從大規(guī)模BC2F1再選擇極端性狀個(gè)體組成混池進(jìn)行QTL-seq，去進(jìn)一步縮小定位區(qū)間。
（3）作者以玉米株高為模式性狀展開QTG-seq研究，在chr7上關(guān)聯(lián)到候選基因Zm00001d020874。
?圖6 QTG定位研究思路圖
2、文章題目：Dissecting a heterotic gene through GradedPool-Seq mapping informs a rice-improvement strategy
發(fā)表期刊：Nature Communications
（1）普通QTL-seq選擇分離群體中極端性狀的子代個(gè)體構(gòu)建2個(gè)混池，而GradedPool-Seq不僅選擇了極端個(gè)體，還把中間表型個(gè)體加入其中構(gòu)成1-2個(gè)混池，最終構(gòu)成“高值組”，“中值組”，“低值組”，再進(jìn)行QTL的定位。相比之下，GradedPool-seq的定位精度通常要優(yōu)于僅使用兩個(gè)極端池進(jìn)行的常規(guī)BSA。
（2）不再使用常見的SNP-index和ED算法進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)，而是采用Ridit（relative to an identified distribution unit）算法會對每個(gè)位點(diǎn)的等位基因頻率進(jìn)行計(jì)算，再對計(jì)算得到的p值進(jìn)行滑窗法擬合，從而顯著降低背景噪音，實(shí)現(xiàn)精細(xì)定位。
總結(jié)
以上都是BSA方法必讀的經(jīng)典文章，從傳統(tǒng)的BSA分析篩選共分離markers，到BSA與高通量測序相結(jié)合的精準(zhǔn)定位策略，極大地拓展了基因定位方法的范圍，能夠讓你從原理到方法全方面的了解BSA，如果后續(xù)開展這方面的研究，這些文章將會促進(jìn)你快速入門。如果還有什么疑惑，歡迎點(diǎn)擊下方按鈕聯(lián)系我們，我們可以為您免費(fèi)進(jìn)行文章研究思路設(shè)計(jì)。
當(dāng)然，在了解BSA理論方法的同時(shí)，親自動手分析也是不可或缺的?？赡苡行┭芯空呔蜁Щ罅?，自己沒有生信基礎(chǔ)，不會敲代碼也不會跑流程，更沒有服務(wù)器等硬件設(shè)備，自己怎么分析BSA數(shù)據(jù)呢？交給服務(wù)公司是個(gè)不錯的選擇，不過項(xiàng)目成本就會增加，而且項(xiàng)目周期一般較長。那么，有沒有一種方式，可以讓研究者既不需要生信基礎(chǔ)，同時(shí)降低項(xiàng)目成本和縮短項(xiàng)目周期呢？
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