研究標題：Multimodal Analysis of Composition and Spatial Architecture in Human Squamous Cell Carcinoma
發(fā)表雜志：CELL（IF:38.634），2020.6.23
簡述：整合高維多組學方法來描述人皮膚鱗狀細胞癌特征，確定了腫瘤特異性角化細胞群體以及腫瘤前沿的免疫浸潤和異質(zhì)性。
研究背景
上皮性腫瘤約占人類惡性腫瘤的90%。cSCC作為其中的一種，是美國第二常見的惡性腫瘤，每年發(fā)病人數(shù)超百萬。盡管可以切除治療，但有高達4%的cSCC會發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并且1.5%的患者最終死亡。近期cemiplimab（PD1抑制劑）的上市給與晚期和轉(zhuǎn)移癌患者以希望，但是腫瘤標志物預(yù)測響應(yīng)的阻力和不足迫切需要更好的對腫瘤微環(huán)境（TME）進行特征描述。本文結(jié)合單細胞測序、空間轉(zhuǎn)錄組等技術(shù)，揭示cSCC的腫瘤異質(zhì)性和免疫機制，為腫瘤和免疫動力學研究提供了支持。
研究方法
一、?實驗材料
二、?實驗技術(shù)
單細胞RNA-seq、空間轉(zhuǎn)錄組測序、多路復(fù)用離子束成像、CRISPR篩選等。
三、實驗流程
實驗結(jié)果
對10例患者手術(shù)切除的腫瘤和原位正常皮膚進行scRNA-seq（圖1A），共獲得48164個單細胞數(shù)據(jù)。通過無監(jiān)督聚類分析確定了腫瘤、正常上皮細胞以及基質(zhì)細胞亞型(圖1B)，并且對骨髓細胞亞群和NK&T細胞亞群進行了細分(圖1C&D)，所有的亞群都與之前的實體瘤scRNA-seq研究相似。細胞類型的比例分析也反映了細胞處理的一致性(圖1E&F)。本研究為cSCC提供了代表性的細胞圖譜。
圖1|正常皮膚和鱗狀細胞癌的單細胞轉(zhuǎn)錄圖譜
重新聚類正常上皮細胞后，在正常皮膚中觀察到3個主要的角質(zhì)細胞（KC）亞群（基底、循環(huán)、分化細胞）。典型相關(guān)分析表明腫瘤KCs廣泛重現(xiàn)了正常(基底、循環(huán)、分化細胞)亞群，在正常皮膚和cSCC中有幾個共享的標記基因(圖2A-D)。有趣的是，在腫瘤細胞聚類中出現(xiàn)了與正常皮膚無明顯關(guān)聯(lián)的第四個KC亞群，即TSK亞群(圖2B-D)。事實上，在這一簇與其他腫瘤細胞區(qū)別開來的100個基因中，有99個基因在腫瘤組織中的表達明顯高于正常組織。TSK標記基因與細胞運動和細胞外基質(zhì)分解有關(guān)，暗示了它的侵入性（圖2E）。TSKs表達經(jīng)典的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標志物，如VIM和ITGA5(圖2F)；但是EMT類似的TSK細胞缺乏經(jīng)典表達EMT轉(zhuǎn)錄因子(圖2H)。因此，我們通過單細胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行推理和聚類，提名AP1和ETS家族成員為潛在控制TSKs的TFs(圖2I)。TSK細胞也表現(xiàn)出較大的EMT評分范圍，提示細胞狀態(tài)具備高可塑性(圖2G)，與EMT連續(xù)模型一致?；准毎˙asal）在腫瘤中的發(fā)生率約是正常循環(huán)細胞的四倍(圖2K)。總的來說，cSCC表現(xiàn)出分化失常，基底細胞迅速增殖，并出現(xiàn)表達EMT連鎖基因的TSK亞群。
圖2|腫瘤角質(zhì)細胞的異常分化層次
在患者中，腫瘤相關(guān)的斑點簇展現(xiàn)出單細胞測序腫瘤KCs的定位基因表達，同時免疫或間質(zhì)基因與腫瘤臨近間質(zhì)、未受累的間質(zhì)或附件區(qū)域有關(guān)聯(lián)，與大體的cSCC結(jié)構(gòu)一致（圖3A）。使用scRNA-seq中TSK標記基因?qū)γ總€空間轉(zhuǎn)錄組斑點評分，顯著突出了一個TSK-high簇，包括TSK標記物MMP10（圖3B&C）。在具有清晰前沿的腫瘤中，TSK鄰近間質(zhì)富集了癌癥相關(guān)成纖維細胞 (CAF)和內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)錄本，表明TSK細胞主要位于纖維血管微環(huán)境中(圖3D)。超過80%的TSK高簇點位于腫瘤前沿，其余的前沿點富集了Basal腫瘤基因(圖3E&F)，這種共存關(guān)系通過共表達標志物COL17A1的免疫組化得到進一步確認（圖3G&H）。此外，炎癥反應(yīng)和干擾素信號基因在非TSK前沿表達，與干擾素相關(guān)轉(zhuǎn)錄本在腫瘤基底群體中的存在一致(圖2E&I)。這些結(jié)果確定了TSK、Basal細胞以及TSK近端纖維血管生態(tài)位造成的cSCC腫瘤前沿的異質(zhì)性。
圖3|空間轉(zhuǎn)錄組反映了前沿異質(zhì)性
圖4|cSCC的免疫景象
利用多重離子束成像（MIBI）技術(shù)，在單細胞分辨率下解析TME的空間組織。我們對6例患者的腫瘤前緣進行了18個視野的MIBI掃描，對38個腫瘤和基質(zhì)/免疫蛋白標志物圖像進行分段，確定了55832個細胞(圖5A)，并且聚類分析的主要細胞類型與scRNA-seq細胞類型相似（圖5B）。間質(zhì)和免疫組分在腫瘤內(nèi)和腫瘤間是可變的，12/17的腫瘤患者圖像聚類不一致(圖5C)。腫瘤內(nèi)外的CD8 T細胞、Tregs、巨噬細胞和CD4 T細胞存在高度相關(guān)性，尤其前兩者更甚(圖5D)。5/12視野具備足夠的細胞進行系統(tǒng)分析CD8 T細胞和Tregs距離(圖5F-H)，我們發(fā)現(xiàn)了兩者的共定位，并且CD8 T細胞的比例也與共定位呈正相關(guān)，表明Tregs受到TME的共招募和CD8 T細胞的共定位共同調(diào)節(jié)，另外CD4 T細胞和巨噬細胞與Tregs共定位(圖5I)。成纖維細胞、巨噬細胞和Tregs在腫瘤-間質(zhì)邊緣最豐富，而CD8 T細胞和中性粒細胞被大量排除在腫瘤之外，表明 Treg 定位可能阻止效應(yīng)淋巴細胞進入腫瘤(圖5J&K)。已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)可以介導(dǎo)免疫抑制或抗腫瘤活性B細胞是唯一表現(xiàn)出優(yōu)先浸潤的細胞類型。
圖5|cSCC中淋巴細胞子集的空間結(jié)構(gòu)
進一步，我們整合scRNA-seq和ST數(shù)據(jù)來描述前沿鄰近腫瘤和TME細胞之間的信號通路(圖6A)?；谂潴w-受體對數(shù)據(jù)庫，TSKs廣參與了自分泌和旁分泌相互作用(主要與CAFs、內(nèi)皮細胞、巨噬細胞和MDSCs)(圖6B&C)。我們使用NicheNet和ST對前沿預(yù)測為調(diào)節(jié)TME特異性細胞類型標記的腫瘤KC配體進行優(yōu)先排序。與TSK-纖維血管生態(tài)位一致的是，對CAFs的顯著TSK信號通路是由幾對TSK-CAF配體-受體對介導(dǎo)的，包括MMP9-LRP1和TNC-SDC1(圖6D&E)。此外，TSKs可通過配體-受體對（PGF-FLT1、PGF-NRP2和EFNB1-EPHB4）調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞。相反地，內(nèi)皮細胞和CAFs顯著共表達NicheNet預(yù)測配體，如TFPI, FN1，和THBS1，這些與TSK受體匹配(圖6F&G)。進一步證實TSKs是一種類似EMT的群體。為了判定TSK細胞是否與多變的TME普遍關(guān)聯(lián)，我們調(diào)研了TCGA數(shù)據(jù)庫中31種實體瘤數(shù)千個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。我們進一步判定TSK配體是否誘導(dǎo)CAF基因（1）伴隨配體CNV缺失，減少CAF基因表達；(2)配體表達和CAF基因的關(guān)聯(lián)(圖6H)，這個在過往研究中被證實。另外TSK細胞可以抑制抗腫瘤免疫。雖然這些研究還不明確TSK細胞是內(nèi)在抵抗還是免疫調(diào)節(jié)活性起作用，但這個亞群提供了一個提高免疫治療的目標方向。
圖6|與前沿生態(tài)位相關(guān)聯(lián)的細胞串擾情景
使用典型的小鼠模型進行腫瘤亞群功能評估，單細胞測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)異種移植SCC細胞的特征與患者樣本基本一致（圖7A-C）。來自患者和異種移植數(shù)據(jù)類似TME細胞類型的比較也顯示，人和小鼠之間共享標記物高度重疊，只有異種移植的少量脊髓細胞存在微妙差異(圖7D&E)。使用患者腫瘤亞群標志物對體外培養(yǎng)的SCC細胞系進行分析，發(fā)現(xiàn)體外細胞在基底、循環(huán)和TSK評分方面表現(xiàn)出較小的異質(zhì)性，這也反映了TME是一個腫瘤細胞群出現(xiàn)的條件(圖7F)。綜上，異種移植模型概括了cSCC ITH的關(guān)鍵特征。
圖7|腫瘤角化細胞缺陷的體內(nèi)CRISPR分析
接下來，使用CRISPR/Cas9技術(shù)對3個鱗狀細胞癌移植瘤株進行篩選（4個亞群，334個富集基因），評估腫瘤KC亞群的功能作用(圖7A)。通過STARS算法，獲得38個命中點，其中18個至少被兩種細胞系共享(圖7F)。特別的，對腫瘤生長重要的基因偏向于在TSK、基底和循環(huán)細胞中表達。腫瘤循環(huán)KCs特有的參與細胞循環(huán)的基因形成了以PCNA和GINS2為中心的最大網(wǎng)絡(luò)。最大的TSK特異性網(wǎng)絡(luò)包括ITGB1、FERMT1、CD151、ARPC2、HSP90B1。ITGB1、CD151和 FERMT1的蛋白產(chǎn)物在細胞表面相互作用，介導(dǎo)整合素信號。通過體外實驗驗證ITGB1、FERMT1和CD151對腫瘤生長的重要性低于體內(nèi)，證實了如果整合素信號介導(dǎo)與TME的通訊，相關(guān)基因在體內(nèi)腫瘤發(fā)生中應(yīng)該比在體外有更大的依賴性的推斷。綜上，體內(nèi)異種移植篩查結(jié)合TCGA分析突出了可能控制亞群特異性致瘤功能的關(guān)鍵基因。
文章總結(jié)
本文整合單細胞RNA測序、空間轉(zhuǎn)錄組和多路離子束成像繪制了人類鱗狀細胞癌組成和空間結(jié)構(gòu)的多模式圖譜，發(fā)現(xiàn)了一個定位于腫瘤前沿的腫瘤特異性角化細胞（TSKs）。TSK在腫瘤微環(huán)境的機制探索，體內(nèi)CRISPR篩選確定的腫瘤亞群致瘤基因網(wǎng)絡(luò)，為腫瘤和免疫動力學研究提供了極大支持。
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