The Architecture of SARS-CoV-2 Transcriptome SARS-CoV-2的轉錄組結構
發(fā)表期刊：Cell
發(fā)表時間：2020年5月
IF：38.637
研究背景
COVID-19是由一種被稱為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）的乙型冠狀病毒引起的。SARS-CoV-2與SARS-CoV、中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV），分別具有80％和50％的同源性，這些病毒在人群中的爆發(fā)表明冠狀病毒具有跨越物種壁壘并在人與人之間傳播的非凡能力。
這篇文章結合了兩種測序方法，Direct RNA sequencing (DRS)和sequencing-by-synthesis (SBS)，明確地繪制了SARS-CoV-2的亞基因組RNA（subgenomic RNAs），ORF和轉錄調(diào)控序列（TRS）。同時發(fā)現(xiàn)了許多與常規(guī)TRS介導的聚合酶跳躍不同的非常規(guī)RNA融合事件。發(fā)現(xiàn)了RNA修飾位點，并測量了gRNA和sgRNA的poly(A)的長度。
研究方法
1.實驗材料：
2.實驗方法：
研究結果
1. SARS-CoV-2的轉錄組結構
用MinION納米孔測序儀進行了DRS測序，獲得了879,679個reads（1.9 Gb）（圖1A）。大部分（65.4％）的reads定位于SARS-CoV-2，表明病毒轉錄本占據(jù)主導地位，而宿主基因的表達被嚴重抑制。已知DRS無法對末端12 nt進行測序，因此序列的5’末端缺失了12 nt（圖1B）。病毒基因組3’端的覆蓋度明顯高于5’端，這也反映了RNA直接測序從RNA3’端開始測序的特點。病毒RNA中前導序列（72nt）的普遍存在導致在5’末端出現(xiàn)一個顯著的峰。在sgRNA的leader-body junction位點檢測到覆蓋度的明顯下降。此外，觀察到反映出非常規(guī)的“拼接”事件的reads，這樣的融合轉錄本導致5’末端覆蓋度的增加（圖1B，插圖）。
?圖1 Direct RNA?seq數(shù)據(jù)分析圖
用DNB-seq確認和檢查CoV基因組的junctions。在junctions處繪制了5’和3’斷點，并通過計算跨越junctions的reads來估算融合頻率（圖2A）。如所預期的，leader代表了最突出的5’ 位點（圖2A，x軸上的紅色星號）。TRS-B被檢測為3’位點的頂端（圖2A，y軸上的紅點）。這些結果證實，SARS CoV-2使用標準的TRS介導的模板轉換機制進行不連續(xù)轉錄，以產(chǎn)生主要的sgRNA（圖2B）?？缭絡unctions reads的定量比較顯示，N RNA是表達最豐富的轉錄本，其次是S，7a，3a，8，M，E，6和7b（圖2C）。
?圖2 病毒亞基因組RNA及其重組位點圖
ORF10僅由DNB數(shù)據(jù)中的一個reads表示（占病毒junction-spanning reads的0.000009％），并且DRS數(shù)據(jù)完全不支持它。ORF10與已知蛋白沒有顯著同源性。因此，ORF10可能不被表達。總而言之，SARS-CoV-2表達了9種規(guī)范性sgRNA（S，3a，E，M，6、7a，7b，8和N）和gRNA。
?圖3 SARS-CoV-2基因組結構示意圖
SARS-CoV-2除了具有預期結構和長度的經(jīng)典sgRNA（圖4D），結果還顯示出許多次要的junction sites（圖4E–4G）。這種融合事件有三種主要類型。第一組中的RNA在位于ORF或UTR中間非預期的3’位點，前導序列（leader）與下游編碼序列（body）結合（圖4E，TRS-L-dependent noncanonical）。第二組顯示了與前導序列沒有相似性的序列之間的遠距離融合（圖4F， TRS-L-independent distant）。最后一組局部融合，這導致較小的缺失，主要發(fā)生在結構基因和輔助基因中，包括S ORF（圖4G，TRS-L-independent local recombination）。
?圖4 典型和非典型融合事件圖
2. SARS-CoV-2的poly(A)長度
由于納米孔DRS基于RNA的單分子檢測，因此它提供了獨特的機會來檢查單個RNA分子的多個轉錄組特征。本文使用自己開發(fā)的軟件根據(jù)DRS數(shù)據(jù)來測量ploy(A)尾的長度（Y. Choi and H.C., unpublished data)。使用此軟件測量發(fā)現(xiàn)，與其他CoV一樣，SARS-CoV-2 RNA帶有ploy(A)尾（圖5A–5B）。病毒RNA尾的中位長度為47 nt。全長gRNA的尾巴比sgRNA更長。值得注意的是，sgRNA具有兩個種群：一個在30 nt處的小峰和一個在45nt處的主峰（圖5B，箭頭）。之前研究發(fā)現(xiàn) bovine CoV mRNA的ploy(A)尾長度在感染過程中發(fā)生了變化，在這項研究中觀察到的30 nt的短尾可能代表易于衰變的老化RNA。與宿主核基因組編碼的mRNA不同，病毒RNA具有均勻的長度分布（圖5C）。
圖5 ?Poly(A) tail長度圖
3. SARS-CoV-2的RNA修飾
研究人員用DRS數(shù)據(jù)檢測了SARS-CoV-2的表觀轉錄組學。病毒RNA修飾在40多年前就已描述過（Gokhale and Horner，2017）。為了明確研究RNA修飾，作者通過體外轉錄病毒序列生成了陰性對照RNA，并對陰性對照進行了直接RNA測序。注意到陰性對照和病毒轉錄本之間的離子電流之間的差異非常有趣（圖6A）。至少有41個位點顯示出實質性差異（頻率超過20％），表明存在潛在的RNA修飾位點。值得注意的是，某些位點顯示的頻率取決于sgRNA的種類。圖6A–6C，S RNA上比N RNA修飾的位點更多，與S RNA相比ORF8 RNA上的修飾頻率更高。此外，修飾的堿基（圖6D，右）的停留時間比未修飾的堿基（圖6D，左）的停留時間長，表明修飾會干擾RNA分子過孔速度。
圖6 RNA修飾位點圖
在41個潛在的修飾位點中，最常見的motif是AAGAA（圖7A和7B）。在整個病毒基因組中都發(fā)現(xiàn)了“AAGAA-like”motif的修飾位點（包括AAGAA和其他富含A/G的序列），尤其是在基因組28,500-29,500處特別豐富（圖7C）。病毒長的轉錄本（gRNA，S，3a，E和M）比短RNA（6、7a，7b，8和N）的修飾頻率更高（圖7D），表明該修飾是特定于某些RNA種類。因為DRS可以同時檢測單個分子上的多個特征，所以作者交叉檢測了poly（A）尾長和內(nèi)部修飾位點。有趣的是，修飾的RNA分子的poly（A）尾比未修飾的短（圖7E）。這些結果表明內(nèi)部修飾和3’尾之間存在聯(lián)系。由于poly（A）尾巴在RNA周轉中起重要作用，因此很容易推測所觀察到的內(nèi)部修飾與病毒RNA穩(wěn)定性控制有關。
圖7 檢測到的RNA修飾差異調(diào)節(jié)圖
討論
在這項研究中，作者描述了SARS-CoV-2的轉錄組和表觀轉錄組。對sgRNA和ORF的明確定位為病毒蛋白功能研究，復制機制以及致病性中宿主-病毒相互作用的提供前提。與RNA病毒一樣，冠狀病毒也經(jīng)常重組，這可能會使它們迅速進化，從而改變其宿主/組織特異性和藥物敏感性，在這項研究中檢測到的頻繁融合可能為變異提供基礎。新的ORF可以作為輔助蛋白，調(diào)節(jié)病毒復制和宿主免疫反應。RNA修飾也可能有助于感染組織中的病毒存活和免疫逃逸。ORF和RNA修飾是SARS-CoV-2特有的還是在其他冠狀病毒中保守的，有待檢查。對它們的分布和功能意義的比較研究將有助于我們更全面地了解SARS-CoV-2和冠狀病毒。
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