ONT全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示了精神疾病風(fēng)險(xiǎn)基因CACNA1C的復(fù)雜剪接特征

 

研究背景

在人腦中，與精神分裂癥相關(guān)的基因組區(qū)域富集了在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中表現(xiàn)出不同異構(gòu)體使用的基因，RNA剪接是將遺傳變異與精神疾病聯(lián)系起來(lái)的關(guān)鍵機(jī)制。剪接圖譜在大腦中特別多樣，很難準(zhǔn)確識(shí)別和量化。短讀長(zhǎng)RNA-Seq方法不能準(zhǔn)確地重建和定量大多數(shù)轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)異構(gòu)體，為解決這一挑戰(zhàn)，本文將long-range PCR和nanopore全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與一種新的生信分析流程結(jié)合。

CACNA1C是一種精神危險(xiǎn)基因，編碼電壓門(mén)控鈣通道CaV1.2，CACNA1C基因很大而且很復(fù)雜，至少有50個(gè)注釋外顯子和31個(gè)預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄本。它的大小和復(fù)雜性使得用標(biāo)準(zhǔn)的基因表達(dá)方法準(zhǔn)確鑒定和量化轉(zhuǎn)錄本變得極其困難，本文在人腦中鑒定了CACNA1C的全長(zhǎng)編碼轉(zhuǎn)錄本，識(shí)別了38個(gè)新的外顯子和241個(gè)新的轉(zhuǎn)錄本，對(duì)異構(gòu)體多樣性的詳細(xì)了解對(duì)于將精神病學(xué)基因組發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為病理生理學(xué)見(jiàn)解和新的精神藥理靶點(diǎn)至關(guān)重要。

研究方法

樣本：來(lái)自利伯腦發(fā)育研究所儲(chǔ)存庫(kù)的三名成年捐贈(zèng)者的尸檢腦組織（提取小腦、紋狀體、背外側(cè)前額葉皮質(zhì)、扣帶回、枕葉和頂葉皮質(zhì)的RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄）
測(cè)序方法：使用PCR擴(kuò)增CACNA1C全長(zhǎng)CDS，使用MinION進(jìn)行測(cè)序
分析流程：https：//github.com/twrze/TAQLoRe

研究結(jié)果

1、CACNA1C有很多外顯子和異構(gòu)體

由于CACNA1C的復(fù)雜性，本文使用了兩種互補(bǔ)的方法來(lái)鑒定轉(zhuǎn)錄本：外顯子水平和剪接位點(diǎn)水平的分析，分析流程見(jiàn)補(bǔ)充圖2。該方法共鑒定了251種存在于人腦中獨(dú)特的CACNA1C轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，其中241種是新的，包括使用新的外顯子，新的剪接位點(diǎn)和連接。

補(bǔ)充圖2

在CACNA1C基因座內(nèi)總共注釋了39個(gè)潛在的新外顯子，其中38個(gè)在至少2個(gè)人或組織中被識(shí)別，并在每個(gè)文庫(kù)中得到至少5條nanopore reads的支持（圖2A）。通過(guò)PCR和Sanger測(cè)序確認(rèn)了新的外顯子與其周圍的注釋外顯子之間的剪接連接，從而驗(yàn)證了四個(gè)新的外顯子。這種新的外顯子的成功驗(yàn)證提供了很高的可信度，即通過(guò)納米孔測(cè)序鑒定的新的外顯子是真實(shí)的，并且被整合到CACNA1C轉(zhuǎn)錄本中。表達(dá)量最高的10條轉(zhuǎn)錄本中，有9條是新的且其中有8條被預(yù)測(cè)保持CACNA1C閱讀框架，這表明這些最豐富的新轉(zhuǎn)錄本中有一些編碼功能不同的蛋白質(zhì)異構(gòu)體（圖2B,C）。這些結(jié)果表明，新的CACNA1C轉(zhuǎn)錄本表達(dá)豐富，數(shù)量也很多，目前的注釋缺少許多最豐富的CACNA1C轉(zhuǎn)錄本。

圖2

通過(guò)設(shè)置轉(zhuǎn)錄本的高置信度，在6個(gè)大腦區(qū)域確定了90個(gè)高可信的CACNA1C轉(zhuǎn)錄本，包括7個(gè)先前注釋的(GENCODE V27)和83個(gè)新的(補(bǔ)充圖3)。7個(gè)新的高置信度轉(zhuǎn)錄本包含新的外顯子，而其余76個(gè)包含以前未描述的連接和連接組合。

補(bǔ)充圖3

上述外顯子水平的轉(zhuǎn)錄本鑒定方法為鑒定新的外顯子和表征全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)提供了穩(wěn)健和保守的手段。使用了更為保守的依賴于連接處無(wú)錯(cuò)誤映射所支持的連接的識(shí)別，以及規(guī)范剪接位點(diǎn)的方法，確定了497個(gè)新的剪接位點(diǎn)，其中393個(gè)由至少10條reads支持，這些剪接位點(diǎn)，在篩選了至少24條reads支持的轉(zhuǎn)錄本后，鑒定了195個(gè)轉(zhuǎn)錄本，其中111個(gè)被預(yù)測(cè)為編碼的。

2、CACNA1C亞型在不同腦區(qū)的表達(dá)譜不同

小腦、紋狀體與皮質(zhì)等組織觀察到了CACNA1C轉(zhuǎn)錄本差異，但在不同個(gè)體之間的表達(dá)是相似的。在小腦中觀察到了明顯的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)轉(zhuǎn)換；在小腦之外，ENST00000399641是主要的轉(zhuǎn)錄本，而在小腦中，ENST00000399641和CACNA1C n2199的表達(dá)水平相似。

圖3 C

3、預(yù)測(cè)新isoforms對(duì)CaV1.2蛋白模型的影響

CACNA1C編碼CaV1.2 的主要成孔亞基。鈣孔由24個(gè)跨膜重復(fù)序列組成，由細(xì)胞內(nèi)環(huán)連接成4個(gè)結(jié)構(gòu)域(I-IV)(圖4A)。在我們鑒定的83個(gè)新的外顯子水平的轉(zhuǎn)錄本中，51個(gè)可能編碼功能性的CaV1.2通道。灰色方框表示新的、框架內(nèi)的插入和刪除的位置（值表示包含每個(gè)isoforms的reads的平均比例）。使用兩種分析方法（外顯子水平和剪切連接水平）鑒定變體的情況，外顯子水平計(jì)數(shù)用于得出豐度(紅色文本)；僅使用剪接位點(diǎn)水平方法鑒定的變體用藍(lán)色文本表示。包含三個(gè)微缺失的蛋白質(zhì)異構(gòu)體的數(shù)量：(I)在I-II接頭中，(Ii)在IV4-5接頭中，以及(Iii)在IV3-4接頭中先前報(bào)道的微缺失(圖4B)。

圖4

總結(jié)

長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展為準(zhǔn)確獲得轉(zhuǎn)錄多樣性提供了可能，因?yàn)槊恳粭lread都包含一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄本。這對(duì)于具有復(fù)雜模型的基因尤其重要。由于CACNA1C剪接產(chǎn)生的CaV1.2蛋白對(duì)現(xiàn)有的鈣通道阻滯劑表現(xiàn)出不同的敏感性，因此有可能選擇性地針對(duì)疾病相關(guān)的CACNA1C亞型和/或那些在大腦與外周差異表達(dá)的CACNA1C亞型，提供既更有效又更無(wú)外周副作用的新型精神藥物。綜上，這些觀察結(jié)果證明了ONT長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序?qū)τ跍?zhǔn)確描述轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)和選擇性剪接的重要性。

參考文獻(xiàn)：
Clark Michael B,Wrzesinski Tomasz,Garcia Aintzane B et al. Long-read sequencing reveals the complex splicing profile of the psychiatric risk gene CACNA1C in human brain.[J] .Mol. Psychiatry, 2020, 25: 37-47.