DNA測(cè)序技術(shù)在過去的40年中，經(jīng)歷了巨大的改進(jìn)與變化。早在1977年，首次報(bào)道了Sanger和Maxam–Gilbert測(cè)序方法，Sanger測(cè)序的最大序列長(zhǎng)度約1 kb。其對(duì)DNA總量的要求較高，一般通過克隆靶標(biāo)DNA序列并連接載體，進(jìn)而通過原核細(xì)胞大腸桿菌(E. coli)擴(kuò)增（當(dāng)時(shí)基因組De novo采用BAC文庫(kù)測(cè)序方式），其讀長(zhǎng)短且耗時(shí)；NGS（Next-Generation Sequencing )二代測(cè)序包含很多技術(shù)平臺(tái)，其特征是對(duì)大量的DNA分子并行測(cè)序，多年來已有4個(gè)主要的NGS平臺(tái)投入商業(yè)使用：羅氏454平臺(tái), Illumina GA/Solexa 平臺(tái), ABI SOLiD平臺(tái)和Life Torrent平臺(tái)。在過去的10年中，Illumina因其低成本，高速和高產(chǎn)而成為測(cè)序市場(chǎng)的主要供應(yīng)商，Illumina測(cè)序平臺(tái)具有廣適性，因此NGS已廣泛用于探索基因組學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，包括腫瘤學(xué)，微生物學(xué)，環(huán)境基因組學(xué)，宏基因組學(xué)及醫(yī)學(xué)，環(huán)境和農(nóng)業(yè)研究等，隨時(shí)其廣泛的應(yīng)用，其劣勢(shì)也逐漸的突顯，即：二代測(cè)序（Illumina為代表）讀長(zhǎng)短仍然是生物學(xué)研究的重要瓶頸，這限制了許多生物學(xué)研究的準(zhǔn)確性，尤其是在基因組組裝研究中。在片段重復(fù)（segmental duplication），結(jié)構(gòu)變異（SV，structural variations）或旁系同源區(qū)段分析中使用短讀長(zhǎng)測(cè)序可能會(huì)導(dǎo)致大量假陽性。盡管測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析在進(jìn)步，但大型基因組的從頭組裝仍然具有挑戰(zhàn)性。自2015年起，以PacBio和Nanopore為代表的長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)開始在動(dòng)植物基因組De novo中初露鋒芒（圖1 A和B）。

圖1 不同測(cè)序技術(shù)讀長(zhǎng)，準(zhǔn)確性及基因組連續(xù)性評(píng)估

一、三代長(zhǎng)讀長(zhǎng)單分子測(cè)序技術(shù)的發(fā)展

?長(zhǎng)讀長(zhǎng)單分子測(cè)序技術(shù)（Long read single-molecule sequencing technology）又稱第三代測(cè)序技術(shù)TGS（Third-Generation Sequencing），早在2004年，由美國(guó)太平洋生物科學(xué)公司Pacific Biosciences (PacBio)?創(chuàng)立的實(shí)時(shí)（SMRT）測(cè)序是較早被廣泛使用的長(zhǎng)讀測(cè)序技術(shù)，SMRT測(cè)序產(chǎn)生的Reads可達(dá)到約200 kb。其提供了技術(shù)上的優(yōu)勢(shì)，以鑒定遺傳變異并進(jìn)一步研究其基因功能，同時(shí)作為動(dòng)植物基因組組裝日臻進(jìn)步完善的主要驅(qū)動(dòng)力，自2015年，首篇純PacBio三代數(shù)據(jù)組裝復(fù)活草（Nature. 2015）基因組見刊Nature，開啟了三代動(dòng)植物基因組De novo的紀(jì)元。與Sanger測(cè)序和NGS測(cè)序類似，PacBio測(cè)序同樣采用邊合成邊測(cè)序的方式，以其中一條DNA鏈為模板，通過DNA聚合酶合成另外一條鏈（圖2 A和B）。PacBio測(cè)序平臺(tái)相繼推出RS II，Sequel和Sequel II平臺(tái)并投入使用（Table 1）。2005年，英國(guó)牛津納米孔技術(shù)公司

圖2 三代PacBio測(cè)序原理

Oxford Nanopore ?Technologies(ONT)創(chuàng)立了單分子納米孔測(cè)序，其主要原理是當(dāng)單鏈DNA/RNA分子的核酸堿基蛋白納米孔時(shí)（固定在鹽溶液浸沒膜上的蛋白質(zhì)納米孔，固定膜上施加了固定電壓），通過創(chuàng)新的技術(shù)識(shí)別離子電流的微小變化，即：當(dāng)DNA分子穿過納米孔時(shí)，相對(duì)于每個(gè)核苷酸，都會(huì)獲得不同的電流信號(hào)。記錄每個(gè)孔的離子電流變化，并基于馬爾可夫模型或遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的方法將其轉(zhuǎn)換為堿基序列（圖3）。其優(yōu)勢(shì)之一是支持RNA直接測(cè)序，除此之外，Ultra-long reads (ULRs) 是ONT平臺(tái)的另一重要特征，并具有促進(jìn)大型基因組組裝的潛力。Nanopore測(cè)序平臺(tái)相繼推出MinION，GridION，PromethION及Flongle平臺(tái)并投入使用（Table 2）。

圖3 三代Nanopore測(cè)序原理

二、三代長(zhǎng)讀長(zhǎng)單分子測(cè)序技術(shù)PacBio和Nanopore的比較

PacBio和Nanopore具有共同的優(yōu)點(diǎn)，即長(zhǎng)讀長(zhǎng)；同時(shí)也具有共同的缺點(diǎn)即高錯(cuò)誤率（糾錯(cuò)前隨機(jī)分布的?5–20％堿基錯(cuò)誤率），隨著新測(cè)序儀和生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，測(cè)序平臺(tái)的優(yōu)缺點(diǎn)有望發(fā)生改變，無論是PacBio還是ONT測(cè)序平臺(tái)都致力于獲得更長(zhǎng)讀長(zhǎng)的reads的同時(shí)，兼獲高準(zhǔn)確的堿基序列信息。

?

圖4 PacBio與Nanopore測(cè)序原理及信號(hào)識(shí)別原理比較

PacBio CCS高精準(zhǔn)測(cè)序：早在2017年，研究人員分別利用了PacBio和Nanopore平臺(tái)測(cè)序進(jìn)行了酵母基因組De novo，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)PacBio測(cè)序平臺(tái)的準(zhǔn)確性略高于Nanopore測(cè)序平臺(tái)(Giordano et al. 2017)。為了解決PacBio較高錯(cuò)誤率的問題，PacBio已升級(jí)了CCS測(cè)序模式以獲得長(zhǎng)讀長(zhǎng)的高保真（HiFi）15 kb reads，Circular Consensus Sequencing (CCS) read: 環(huán)形一致性序列，這種一致性序列通過對(duì)來自單個(gè)ZMW中的subreads進(jìn)行比對(duì)產(chǎn)生。產(chǎn)生的CCS reads使用CCS算法需要至少三輪讀取來自插入片段的subreads，單條CCS read準(zhǔn)確性可達(dá)99%以上（圖5）。Sequel II System 2.0版本試劑雖然使得HiFi文庫(kù)的插入片段長(zhǎng)度提升至15-20 kb，從而更好的支持基因組從頭組裝，但是對(duì)于組裝來說，長(zhǎng)度仍有較大的提升空間。

圖5 PacBio CCS測(cè)序原理及準(zhǔn)確性評(píng)估

Nanopore超長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序：盡管組裝方法不斷在改進(jìn)，且已開發(fā)物理圖譜技術(shù)（光學(xué)圖譜），但讀長(zhǎng)長(zhǎng)短仍然是高質(zhì)量動(dòng)植物基因組的限制因素。如植物基因組由于高雜合，及其復(fù)雜的多倍性和高重復(fù)含量，其組裝仍然具有挑戰(zhàn)性，讀長(zhǎng)必須超過基因組中的主要重復(fù)序列長(zhǎng)度，及嵌合的長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）或單倍型Blocks，其長(zhǎng)度可能跨越20–200 kb。雖然PacBio是提供Long Reads（>1 kb）的技術(shù)，且通常 Reads N50長(zhǎng)度可大于20 kb，但即便是幾乎完美的15 kb reads可能無法組裝復(fù)雜植物基因組中經(jīng)常出現(xiàn)的嵌合及高度相似的重復(fù)序列。而ONT測(cè)序平臺(tái)大大解決了這一問題，與PacBio reads平均長(zhǎng)度項(xiàng)目（圖6），一小部分ONT reads讀長(zhǎng)超過300 kb，同時(shí)PacBio不包含任何大于150 kb的reads。許多復(fù)雜的植物基因組具有大于20 kb或更長(zhǎng)的重復(fù)序列，所以即便目前ONT具有一定錯(cuò)誤率，但其大大促進(jìn)了基因組的組裝，從而顯著提高了基因組連續(xù)性或完整性。例如：使用ONT測(cè)序更新的擬南芥Col-0基因組最終通過組裝，減少到40個(gè)Contigs，且跨越了染色體臂（端粒到著絲粒），同時(shí)解決了前期在TAIR10參考基因組中存在的gaps及組裝錯(cuò)誤(Jupe et al. 2020)。

圖6 三代Nanopore和PacBio測(cè)序讀長(zhǎng)比較

三、百邁客雙平臺(tái)(Nanopore+PacBio）動(dòng)植物基因組De novo研究策略—魚和熊掌可兼得

“魚，我所欲也，熊掌亦我所欲也；二者不可得兼，舍魚而取熊掌者也。正如在動(dòng)植物基因組研究中，針對(duì)基因組組裝，為了兼顧長(zhǎng)讀長(zhǎng)的同時(shí)，獲得高準(zhǔn)確性的物種基因組密碼信息，在選擇測(cè)序技術(shù)選擇(PacBio or Nanopore?)上總會(huì)有魚和熊掌不可兼得的感覺。長(zhǎng)久以來，百邁客一直致力于成為“專業(yè)的基因組組裝專家”，擁有雙平臺(tái)的基礎(chǔ)上（2015年首次引進(jìn)PacBio平臺(tái)；2017年首次引進(jìn)Nanopore平臺(tái)），力求整合雙平臺(tái)各自的優(yōu)勢(shì)，著力于開發(fā)各種軟件、算法，為每個(gè)物種提供訂制的“基因組套餐”，即打造高質(zhì)量，高完整性的物種基因組。從本章節(jié)起，小編后續(xù)會(huì)結(jié)合新的技術(shù)策略、測(cè)試數(shù)據(jù)及文章案例，為大家?guī)砣碌幕蚪M研究策略，旨在獲得高度連續(xù)性基因組的前提下，同時(shí)完成高準(zhǔn)確性動(dòng)植物基因組密碼的破譯，即魚與熊掌可兼得。

首先通過百邁客三代Nanopore和PacBio平臺(tái)相關(guān)物種測(cè)序讀長(zhǎng)（表1）及組裝結(jié)果的比較（表2），進(jìn)一步通過我們的實(shí)際案例來看一下Nanopore測(cè)序平臺(tái)在基因組組裝中的優(yōu)勢(shì)。

表1 Nanopore與PacBio平臺(tái)實(shí)測(cè)物種數(shù)據(jù)讀長(zhǎng)比較

通過雙平臺(tái)實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)的比較分析: Nanopore平臺(tái)平均讀長(zhǎng)為28.5 Kb左右，Reads N50平均讀長(zhǎng) 38Kb左右；PacBio CLR平均讀長(zhǎng)20 Kb左右，Reads N50平均讀長(zhǎng) 28Kb左右；CCS平均讀長(zhǎng)12-15 Kb，Reads N50 16~18Kb，發(fā)現(xiàn)Nanopore比PacBio平臺(tái)讀長(zhǎng)高10 Kb左右，而PacBio CCS模式讀長(zhǎng)遠(yuǎn)低于CLR模式。

同時(shí)通過PacBio和Nanopore雙平臺(tái)測(cè)序數(shù)據(jù)組裝結(jié)果的比較發(fā)現(xiàn)，利用PacBio數(shù)據(jù)進(jìn)行基因組組裝Contig N50一般達(dá)到Mb級(jí)別，而利用Nanopore數(shù)據(jù)進(jìn)行基因組組裝，Contig N50指標(biāo)平均水平基本能再提升2倍或者更高，甚至許多物種能達(dá)到幾十Mb（如百邁客利用Nanopore測(cè)序平臺(tái)組裝的水產(chǎn)動(dòng)物綠鰭?cǎi)R面鲀基因組，Contig N50高達(dá)22 Mb）。

表2?Nanopore與PacBio平臺(tái)實(shí)測(cè)物種組裝指標(biāo)比較

由于Nanopore測(cè)序Reads讀長(zhǎng)長(zhǎng)，PacBio Sequel II HiFi模式測(cè)序準(zhǔn)確性高達(dá)99%以上，為了同時(shí)利用其雙平臺(tái)各自的優(yōu)勢(shì)，我們擬通過Nanopore測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)某多倍體植物進(jìn)行基因組組裝，同時(shí)通過低深度PacBio CCS數(shù)據(jù)進(jìn)行Polish，進(jìn)而對(duì)該多倍體植物基因組連續(xù)性，完整性及準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)估，以獲得高連續(xù)性，高準(zhǔn)確的基因組密碼信息，測(cè)試結(jié)果如下：

1. 某多倍體植物組裝基本信息

2.?采用不同深度下的PacBio CCS數(shù)據(jù)進(jìn)行Polish，然后利用真核有胚植物數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)不同深度PB CCS Polish的結(jié)果進(jìn)行BUSCO完整性評(píng)估，以獲得最佳的CCS數(shù)據(jù)矯正深度，分析結(jié)果如下：

分別利用5x，10x，15x和20x的PacBio CCS數(shù)據(jù)進(jìn)行Polish，發(fā)現(xiàn)當(dāng)利用10xCCS數(shù)據(jù)進(jìn)行Polish后，隨著CCS數(shù)據(jù)深度的增加（15x，20x），BUSCO完整性比率無進(jìn)一步提升，基本在97.43%左右，通過CCS數(shù)據(jù)矯正的梯度設(shè)置，進(jìn)一步證明了10x PacBio CCS數(shù)據(jù)足以保證基因組完整性評(píng)估。

3.?采用不同測(cè)序平臺(tái)數(shù)據(jù)對(duì)Nanopore原始組裝結(jié)果進(jìn)行Polish，進(jìn)而利用真核有胚植物數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BUSCO完整性評(píng)估，完整性比對(duì)結(jié)果如下：

通過比較Nanopore數(shù)據(jù)原始組裝、Nanopore Polish、Nanopore Polish+二代Polish及PacBio CCS Polish后基因組的完整性，發(fā)現(xiàn)基因組的BUSCO完整性比例逐漸升高，分別為：77.01%，93.96%，95.28%和97.43%，當(dāng)利用10 x PacBio CCS數(shù)據(jù)Polish后，BUSCO完整性比例最高，約為97.43%，說明了前期推測(cè)的準(zhǔn)確性，即可利用高深度的Nanopore數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝以提升基因組組裝指標(biāo)，進(jìn)而利用低深度的PacBio CCS數(shù)據(jù)提升基因組完整性。

4.?不同深度CCS 數(shù)據(jù)Polish后二代數(shù)據(jù)回比結(jié)果

利用5x，10x，15x和20x的PacBio CCS數(shù)據(jù)對(duì)基因組進(jìn)行Polish，然后利用50x的二代數(shù)據(jù)回比到基因組上，最后發(fā)現(xiàn)回比率相當(dāng)，雙端比對(duì)效率97%左右。

5.?通過將20?x?CCS數(shù)據(jù)分別回比到10 x PacBio CCS polish及100 x Nanopore+50 x Illumina Polish后基因組，截取基因組上特性區(qū)域，進(jìn)行組裝基因組單堿基準(zhǔn)確性的比對(duì)與評(píng)估，發(fā)現(xiàn)10?x?PacBio CCS polish后的結(jié)果提升效果明顯，我們挑選了幾個(gè)實(shí)例如下：

區(qū)域1：

PacBio CCS回比結(jié)果（10x CCS Polish基因組）

PacBio CCS回比結(jié)果（100 x ONT+50 x Illumina Polish基因組）

區(qū)域2：

PacBio CCS回比結(jié)果（10x CCS Polish基因組）

PacBio CCS回比結(jié)果（100x Nanopore+50x Illumina Polish基因組）

上述分析結(jié)果中，進(jìn)一步證實(shí)了前期的推測(cè)，利用Nanopore超長(zhǎng)讀長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)，組裝獲得高連續(xù)性基因組（Contig N50 約10 Mb），同時(shí)結(jié)合PacBio CCS高準(zhǔn)確性測(cè)序，進(jìn)一步提升基因組中單堿基的準(zhǔn)確度，即魚和熊掌可兼得。高連續(xù)性基因組的獲得，對(duì)后續(xù)功能基因定位，結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)具有重要的意義；同時(shí)高準(zhǔn)確的基因組的獲得，對(duì)于超大基因組，多倍體基因組等復(fù)雜基因組的LTR的熱點(diǎn)區(qū)域的研究更具突破性的意義。除此之外。在很多動(dòng)植物基因組上的確存在高度復(fù)雜的區(qū)域，即使通過高深度PacBio?CCS數(shù)據(jù)依然無法矯正，這就需要通過其它相應(yīng)的技術(shù)及軟件參數(shù)整合來提升基因組的準(zhǔn)確性。

四、雙平臺(tái)(Nanopore+PacBio）基因組De novo高分文章賞析

文章案例1：同源多倍體紫花苜?；蚪M

期刊：Nature Communications

發(fā)表時(shí)間：2020年5月

基因組De novo策略：PacBio CCS+ONT+ALLHiC

在對(duì)同源四倍體紫花苜蓿（Medicago sativa?L.）基因研究中，首先利用了70 GB，~22x PacBio CCS數(shù)據(jù)進(jìn)行基因組組裝，組裝獲得紫花苜?；蚪M大小3154 Mb，Contig N50=459 kb, 然后利用ALLHiC進(jìn)行同源染色體組群的劃分，最后通過Hi-C互作熱圖、遺傳圖譜共線性、ONT數(shù)據(jù)回比、BUSCO完整性、轉(zhuǎn)錄組對(duì)基因組完整性等進(jìn)行評(píng)估，值得注意的是在ONT數(shù)據(jù)回比評(píng)估中（Table 3)，文中篩選了99 GB ONT long reads中的最長(zhǎng)200條reads（ranged from 95 to 263 Kb）進(jìn)行回比，發(fā)現(xiàn)89%的的reads都能比對(duì)到single染色體上，結(jié)合其它評(píng)估方法，進(jìn)一步說明了組裝及染色體位置的準(zhǔn)確性。

文章案例2：小墊柳基因組

期刊：Nature Communications

發(fā)表時(shí)間：2019年11月

基因組De novo策略：ONT+PacBio +HiC

在小墊柳（Cushion willow）基因組組裝中，首先利用SMARTdenovo對(duì)糾錯(cuò)后的74xONT數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，然后分別利用125xPacBio數(shù)據(jù)(two rounds )與Illumina數(shù)據(jù)(five rounds )進(jìn)行polish，基因組完整性評(píng)估后，利用Hi-C將Contig掛載到染色體水平，最終組裝獲得小墊柳基因組大小339.588 Mb，Contig N50=9.522 Mb。?(Table 4)

五、百邁客Nanopore、PacBio平臺(tái)動(dòng)植物基因組合作文章總覽(部分）

北京百邁客生物科技有限公司自2015年引入Pacbio測(cè)序平臺(tái)，2017年初引入Nanopore測(cè)序平臺(tái)以來，截止到目前百邁客已擁PacBio平臺(tái)：RS Ⅱ、PacBio Sequel、PacBio sequel Ⅱ；Nanopore 平臺(tái)：PromethION-48、PromethION-β、Nanopore GridION、MinION，擁有主流三代測(cè)序儀，尤其針對(duì)復(fù)雜超大基因組測(cè)序，百邁客生物具有三代測(cè)序通量，以滿足超大基因組的組裝需求。同時(shí)PacBio和Nanopore兩大主流三代測(cè)序平臺(tái)各自及組合經(jīng)驗(yàn)，為老師們提供了可參考且全面優(yōu)質(zhì)的選擇！選擇我們，提供專屬于您基因組套餐！

百邁客現(xiàn)提供測(cè)序分析+分子試劑一站式解決方案：基因表達(dá)量驗(yàn)證：反轉(zhuǎn)試劑盒+qPCR試劑盒；SNP驗(yàn)證：PCR Mix；克隆驗(yàn)證：PCR Mix+無縫克?。籇NA、RNA提取試劑盒解決疑難物種提取。期待與您的合作！??！

參考文獻(xiàn)：

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