三代重測序助力阿爾茲海默癥研究

2019年3月在Acta Neuropathologica雜志（IF=15.87）發(fā)表了一篇Loss of DPP6 in neurodegenerative dementia: a genetic player in the dysfunction of neuronal excitability 文章。簡單一句話介紹就是，作者采用二代和三代Nanopore重測序數(shù)據(jù)找到了DPP6上的4M大小的倒位，并采用二代測序數(shù)據(jù)大隊列研究DPP6基因的變異對阿爾茲海默癥的影響。

摘要

新出現(xiàn)的證據(jù)表明，神經(jīng)退行性腦疾病(NBD)中存在一種匯聚機制，早期神經(jīng)網(wǎng)絡功能障礙和神經(jīng)穩(wěn)態(tài)的改變，這些都是神經(jīng)退行性疾病的罪魁禍首。本研究中，作者采用二代測序和三代長read全基因組測序來研究常染色體顯性遺傳史的癡呆家族顯著關聯(lián)的7q36。他們識別并驗證了4Mb的倒位在疾病單倍型中分離，并擾亂了DPP6基因的編碼序列。在早發(fā)性阿爾茲海默癥和額顳葉癡呆中，利用DPP6基因的重測序技術識別了更多罕見的非同義突變，移碼突變和無義突變。

DPP6是一個II型跨膜蛋白，有著高度結構的細胞外的結構域，并且主要在腦中表達。DPP6與鉀通道K_v4.2形成多聚體復合物，調(diào)節(jié)腦中電壓依賴性門控特性。K_v4.2在大腦中的表達在神經(jīng)元興奮性中起關鍵作用。體外模擬發(fā)現(xiàn)患者的無義突變會改變DPP6，并降低薄膜表達進而導致蛋白的缺失。在無義突變攜帶者上可以檢測到DPP6和K_v4.2表達降低。同時DPP6的缺失會導致神經(jīng)過度興奮，敲除Dpp6的小鼠的行為會發(fā)生改變?？偠灾珼PP6作為癡呆研究中的新基因，能夠加強神經(jīng)過度興奮，并能改變神經(jīng)細胞啟動的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

測序方法

二代重測序：4個1270患病家族中第三代的子女；

三代重測序：上述4個樣品中的patient III-48以及10名無關癡呆患者和對照組樣品，采用牛津納米孔公司（Oxford?Nanopore?Technologies，簡稱ONT）的高通量測序平臺PromethION測序儀進行長read基因組測序，首先用Megaruptor 將DNA被打斷成35Kb，并采用BluePippin 選擇最短6kb的片段進行文庫制備和測序；

DPP6基因重測序：對558個早發(fā)性阿爾茲海默癥患者（EOAD，平均發(fā)病年齡61.6±6.8）和614個額顳葉癡呆患者（FTD，平均發(fā)病年齡66.1±9.9），采用Illumina公司 Miseq測序儀對DPP6基因完整的編碼區(qū)域重測序。

分析結果

1270家族的二代測序結果

先前對1270家族的7q36的遺傳分析識別了五個不同基因（ABCF2, GALNT11, DPP6, PAXIP1, EN2 ）的七個變異，且在1270家族的疾病單倍型中是分離的。大多數(shù)這些變異是同義突變，并且只有PAXIP1 p.A660變異在對照個體中是缺失的。目前公開的基因數(shù)據(jù)（如ExAc）顯示，PAXIP1存在不同的核苷酸變化，導致同樣的沉默突變（p.A660），這使得PAXIP1不太可能具有有害影響。此外，我們沒有發(fā)現(xiàn)PAXIP1在患者淋巴母細胞中異常剪接的證據(jù)。

對1270家族的第三代4個患病的兄弟姐妹（III-12，III-38，III-41，III-48）進行WGS測序。選擇4個患者共有的注釋的高質(zhì)量的遺傳變異，罕見的（千人基因組計劃中<1%）或者雜合的非編碼變異進行后續(xù)研究。在STR標記D7S636和D7S559上連鎖區(qū)域的位點保留了79個非編碼的變異。驗證和分離分析保留了38個非編碼變異，這些變異在1270家族的疾病單倍型中共分離。對照個體中的變異的基因型顯示4個變異對于1270家族是唯一的。其中3個變異均位于DPP6基因的1號內(nèi)含子上，另一個變異位于基因間區(qū)（距SHH基因最近，27.3Kb）距離DPP6基因下游908kb。而這四個變異在ENCODE注釋都不具有潛在的高度破壞性。

注：共分離是指在有性繁殖的后代，假如基因附近有一緊密連鎖的分子標記，在細胞減數(shù)分裂時分子標記與基因之間由于相距太近很少有機會發(fā)生交換，那么這種分子標記與連鎖的基因有最大的可能同時出現(xiàn)在同一個個體中。

為了排除是連鎖區(qū)域外的編碼變異引起的疾病，作者提取了WGS數(shù)據(jù)的外顯子，并且分析了罕見的及新的編碼非同義變異。選擇四個患者共有的雜合變異（UTRs，同義和非同義）。只驗證了出現(xiàn)在已知的蛋白編碼基因的罕見或者新的變異。這個選擇產(chǎn)生了9個非同義突變，如下表，但卻在1270家族中沒有與疾病共分離。

連鎖7q36區(qū)域存在4Mb的反轉(zhuǎn)破壞了DPP6序列

作者設計引物擴增連鎖區(qū)域去證實這些變異，結果發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物在兩個7號染色體的位點比對到了相反的方向，且距離將近4Mb。7號染色體上的局部比對，證實了反向雜合低拷貝重復的出現(xiàn)。遠端的斷點位于7q36.2連鎖區(qū)域上，DPP6基因的1號內(nèi)含子上，被預測改變了基因的編碼序列；臨近的倒位斷點位于連鎖區(qū)域之外。

作者對III-48號樣品進行三代測序去驗證前面推測的結果。作者采用PromethION測序?qū)II-48號患者進行測序，約6X覆蓋度，得到21.2G數(shù)據(jù)。在七號染色體的149,704,610–153,786,893區(qū)域發(fā)現(xiàn)了倒位。而這個7q36.2倒位（在DPP6基因的1號內(nèi)含子上存在斷點），卻沒有在先前的209個無關個體的二代WGS數(shù)據(jù)中被發(fā)現(xiàn)。同時用三代ONT平臺產(chǎn)生的10個癡呆患者和對照患者也都沒有出現(xiàn)這個倒位。

DPP6上的罕見變異與神經(jīng)退行性癡呆相關

為了更好的理解DPP6對于退行性癡呆(NBD)的遺傳貢獻，作者對558個早發(fā)性阿爾茲海默癥（EOAD）和614個額顳葉癡呆患者（FTD）的DPP6編碼外顯子進行測序并識別罕見的蛋白改變的變異。在2個FTD患者中識別到兩個終止密碼子突變（PTC），p.E79Gfs*9 和p.Q23O* ，且在755個對照組中是缺失的。此外，在阿爾茲海默癥（AD），F(xiàn)TD及對照組的1號外顯子上識別到了22個錯義變異以及大小變化的Gly插入/缺失。最后發(fā)現(xiàn)DPP6基因上罕見變異與AD、FTD顯著的關聯(lián)。

罕見變異改變患者腦組織中DPP6表達水平

只有3個攜帶DPP6無義突變的患者的解剖大腦被凍存。這三個患者的神經(jīng)病理學診斷分別是阿爾茲海默癥AD，F(xiàn)TLD-TDP typeD（FTD行為變異和佩吉特氏骨?。?，F(xiàn)TLD-ALS type B（FTD行為變異及球類型）。結果發(fā)現(xiàn)三個DPP6變異(p.P509R, p.R47L, and p.D596N)?的mRNA表達水平顯著下調(diào)，并且發(fā)現(xiàn)p.P509R和p.R47L 攜帶者的DPP6蛋白表達水平也顯著下降。

 

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