外顯子測序揭示畸形精子癥男性不育近親家系FBXO43純合突變

近日，蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)者發(fā)表了有關(guān)畸形精子癥男性不育相關(guān)研究，該研究中外顯子測序由百邁客生物科技有限公司完成，詳情如下：

研究方法

1. 形態(tài)學(xué)分析：通過透射電子顯微鏡觀察精子形態(tài)異常

2. 全外顯子組測序鑒定候選致病基因：先證者所在近親家系（4例，先證者、先證者弟弟及其父母），突變位點篩選及保守性分析

3. 突變位點驗證：sanger測序驗證篩選后的候選突變位點

4. 預(yù)測突變后蛋白結(jié)構(gòu)變化：Swiss-Model蛋白結(jié)構(gòu)建模及可視化

5. 大量散發(fā)樣本驗證：124名患有畸形精子癥的散發(fā)性不育男性患者和200名正常生育的男性對照中進行單個基因靶向測序，篩查散發(fā)病例中的突變

研究結(jié)果

1、患者表型–形態(tài)學(xué)分析

本研究中涉及的為甘肅省回族一個近親結(jié)婚家系，其中兩兄弟都沒有孩子，并且患有生育障礙。許多以前的精液分析顯示出嚴(yán)重的畸形精子癥。兩兄弟以前沒有重大疾病的記錄，檢查顯示正常的男性血清激素水平，正常的46,XY 核型和Y染色體微缺失。

形態(tài)學(xué)分析顯示嚴(yán)重的完全畸形精子癥，主要的異常是嚴(yán)重的無定形頭，具有空泡和過剩的殘留細胞質(zhì)（圖1F）。來自兩兄弟的精子在頭部出現(xiàn)畸形（圖1G和H）。精子呈現(xiàn)較大的無定形頭和腔隙染色質(zhì)缺陷（空泡），具有豐富的殘留細胞質(zhì)。

2、WES鑒定FBXO43 C1991T純合突變

對兩兄弟及其父母進行了全外顯子組測序WES，平均覆蓋深度為120×，目標(biāo)區(qū)域覆蓋度為99.87％。排除在任何變異數(shù)據(jù)庫中MAF>0.05的變異，錯義突變、無義突變、移碼突變和剪接位點突變等優(yōu)先保留。此外，SIFT、PolyPhen-2和Mutation Taster等同時預(yù)測為具有潛在有害性的變異也被保留用于進一步評估。

由于父母為近親結(jié)婚，首先考慮常染色體隱性遺傳模式，確定了2個具有功能喪失突變或潛在有害的錯義突變位點。結(jié)合基因功能分析等條件過濾后，鎖定了一個新的非同義突變FBXO43（C1991T，p.G664D）。通過Sanger測序，證實了2個兄弟存在FBXO43中的C1991T純合突變。先證者的父母攜帶雜合突變。

3、FBXO43純合突變的保守性和結(jié)構(gòu)功能分析

FBXO43基因C1991T（G664D）純合突變位于5號外顯子（圖2A）。FBXO43蛋白質(zhì)包括?F-box和C-端的ZBR（鋅結(jié)合區(qū)）（http://www.uniprot.org/uniprot/Q4G163）。殘基G664D位于FBXO43蛋白的C端ZBR中（圖2B），殘基G664在Euteleostomi（真硬骨動物）中高度保守（圖2C）。非同義突變G664D不存在于1000G以及ExAC數(shù)據(jù)庫中。此外，SIFT、PolyPhen-2和Mutation Taster預(yù)測G664D突變可導(dǎo)致蛋白功能變化（有害）。

（注：該圖中除C1991T（G664D）外，其他突變?yōu)樵谏l(fā)樣本中發(fā)現(xiàn)的FBXO43基因突變）

FBXO43（c.1991C>T）非同義突變導(dǎo)致FBXO43蛋白664殘基從非極性氨基酸（Gly甘氨酸）轉(zhuǎn)變?yōu)閹ж?fù)電荷的氨基酸（Asp天冬氨酸）（G664D）。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)通過in silico結(jié)構(gòu)模型預(yù)測，與野生型相比，具有2個明顯縮短的β-折疊（殘基654-668）、額外產(chǎn)生的α-螺旋（殘基610-613）和明顯變化的loop（殘基583-618）。

4、散發(fā)樣本FBXO43突變篩查

為了評估更廣泛人群中FBXO43的突變，對散發(fā)不孕患者和未受累對照進行了FBXO43基因突變篩查。所有散發(fā)不孕的患者均為甘肅省漢族人。主要的異常是無定形精子頭，具有可變比例的空泡和過剩的殘留細胞質(zhì)。其他精液參數(shù)因不同患者而異，包括不同的精子濃度水平（41.61±32.48×106/ml）和不同精子活力（45.397％±22.83％）。

在124名散發(fā)患者中有4名（3.2％）攜帶FBXO43雜合突變。這4名患者均出現(xiàn)不孕和畸形精子癥。此外，這些突變也不存在于1000 Genomes Project和ExAC數(shù)據(jù)庫中（表1）。殘基E594、I250、G149和E98在Euteleostomi（真硬骨動物）中也是保守的（圖2C）。

為了排除所鑒定的突變在研究群體中是常見突變的可能性，對來自中國200個可育個體的FBXO43外顯子進行了突變篩查。進行精液分析和生育有后代的200名可育人群均為甘肅省漢族人。然而，在200個對照個體中沒有發(fā)現(xiàn)任何致病性FBXO43突變。

小結(jié)

作者在一個中國近親家庭的2個不育兄弟中發(fā)現(xiàn)了FBXO43基因突變。臨床篩查和遺傳分析結(jié)果支持FBXO43突變可能與以畸形精子癥為特征的男性不育相關(guān)。在臨床ICSI（Intracytoplasmic sperm injection，即卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)）中，精子的質(zhì)量基于形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并且在一些不育個體中重復(fù)治療失敗的確切原因在很大程度上是未知的。因此，對畸形精子癥的遺傳基礎(chǔ)的研究可能揭示精子發(fā)育背后的其他基因和相應(yīng)的機制。本研究研究結(jié)果為男性不育的分子診斷提供了候選基因，并擴展了對FBXO43突變的致病作用的認(rèn)識，需要進一步的研究來探索FBXO43的功能并深入了解畸形精子癥可能的遺傳基礎(chǔ)。

參考文獻：

MA, Ying, et al. A novel homozygous FBXO43 mutation associated with male infertility and teratozoospermia in a consanguineous Chinese family. Fertility and sterility, 2019.

 

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