Hi-C是以整個細(xì)胞核為研究對象，利用高通量測序技術(shù)，結(jié)合生物信息分析方法，研究全基因組范圍內(nèi)整個染色質(zhì)DNA在空間位置上的關(guān)系，獲得高分辨率的染色質(zhì)調(diào)控元件相互作用圖譜。Hi-C常與RNA-Seq等多組學(xué)技術(shù)進(jìn)行聯(lián)合分析，從基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和表觀遺傳網(wǎng)絡(luò)來闡述生物體性狀形成的相關(guān)機(jī)制。
小編此前給大家介紹過Hi-C技術(shù)的應(yīng)用及與多組學(xué)技術(shù)搭配的案例解讀。在Hi-C技術(shù)的“硬件”條件鋪墊之后，執(zhí)著于樣本制備階段的小編，要來普及一下“軟件”環(huán)節(jié)的注意事項(xiàng)了。
萬丈高樓平地起。再高超的技術(shù)，再前衛(wèi)的應(yīng)用方向，也要基于項(xiàng)目的樣本質(zhì)量才能順利推進(jìn)，樣本準(zhǔn)備環(huán)節(jié)便是一個項(xiàng)目整體的奠基石。
做Hi-C所涉及的樣本通常有全血樣本，組織樣本以及細(xì)胞樣本。
血液樣本
送樣建議
血液采集后加入含EDTA或檸檬酸鈉抗凝管中（因肝素鈉抗凝會影響酶活性，故不建議用肝素鈉抗凝），輕輕顛倒十次混勻，室溫正立放置，平衡2h后立即送樣，并盡量確保24h內(nèi)運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。
注意事項(xiàng)（防止污染、溶血）
a. 血液必須為新鮮血樣。
b. 取樣前要進(jìn)行消毒處理：包括取樣部位、取樣器材、取樣者戴的手套等，防止所取血液樣品被物種本身攜帶的細(xì)菌等污染物污染；
c. 準(zhǔn)備檸檬酸鈉或EDTA抗凝管；
d. 依據(jù)抗凝管的實(shí)際規(guī)格采取全血樣品，比如：10 ml規(guī)格的抗凝管可以取樣10 ml；
e. 取完血后，迅速輕柔顛倒混勻全血樣品，保證血液與抗凝劑充分混勻；
f. 天氣較熱時：含有血液樣品的抗凝管運(yùn)輸時使用冰袋低溫運(yùn)輸，注意，冰袋不要與抗凝管直接接觸，以防止血液凍凝；天氣較冷時：含有血液樣品的抗凝管運(yùn)輸時無需加冰袋運(yùn)輸。
組織樣本
送樣建議
將肌肉表面附著的血液、脂肪、毛皮等非肌肉組織處理干凈，簡單梯度凍存（4℃ 30 min，,-20℃ 30 min，放于-80℃長期保存），干冰運(yùn)輸。
注意事項(xiàng)（防止污染、溶血）
a. 凍存樣品注意—“慢凍快融”；
b. 保證組織樣品新鮮凍存，保存時間不要太長（以凍存時間1個月為宜）。
細(xì)胞樣本
送樣建議
需要進(jìn)行甲醛交聯(lián)固定，細(xì)胞不可經(jīng)過核酸染色步驟，交聯(lián)前處于活性狀態(tài)，冷凍細(xì)胞需活化后在進(jìn)行交聯(lián)。建議培養(yǎng)到10^7個細(xì)胞用于固定，以保證試驗(yàn)的可重復(fù)性。
交聯(lián)細(xì)胞步驟建議
1、細(xì)胞交聯(lián)
a. 取新鮮活細(xì)胞置于1.5 ml離心管中，加入1 ml的cold 1x PBS搖勻，1000 g、4℃離心2 min；
b. 吸棄上清，每管再次加入1 ml的cold 1xPBS輕混勻，1000 g、4℃離心2 min；
若不進(jìn)行細(xì)胞裂解，則改成?b. 1 ml cold PBS 重懸沉淀，把重懸液轉(zhuǎn)移到凍存管，340-600 g、4℃離心 8 min 去上清。
注：做到此步可直接液氮速凍，干冰運(yùn)輸，信息單中備注：“交聯(lián)完成，PBS清洗后，未進(jìn)行細(xì)胞裂解”。
c．吸棄上清，用1 ml cold 1x PBS重懸沉淀，加入適量（57 ul）37%甲醛（終濃度2%）混勻,室溫放置10 min(1-2 min混勻一次)；
d．加適量（71 ul）2 M的氨基乙酸（4℃保存）終止反應(yīng)（終濃度0.125 M）室溫混勻5 min,冰上放置15 min。
2.細(xì)胞裂解
a．固定好的細(xì)胞340-600 g、4℃離心8 min，棄上清；
b．1 ml cold PBS重懸沉淀，340-600g 4℃ 離心8 min；
c．用1.25 ml cold lysis buffer（50 ml lysis buffer 加一片羅氏蛋白酶抑制劑）重懸沉淀，冰上靜止30 min(5min混勻一次)；
d．600 g 、4℃ 離心5 min沉淀細(xì)胞核,核可用液氮凍存運(yùn)輸。
以上，便是Hi-C常規(guī)樣本的制備細(xì)節(jié)，望對有意向或有計(jì)劃準(zhǔn)備樣本的老師同學(xué)們有所幫助。對送樣樣本的嚴(yán)格把關(guān)，是推進(jìn)項(xiàng)目的第一步。如對制備樣本上或非常規(guī)樣本的制備有疑問，可點(diǎn)擊下方按鈕聯(lián)系我們，我們將給您提出更佳的建議。
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