ATAC-seq（Assay for Transposase – Accessible Chromatin with highthroughput sequencing），是一種通過(guò)使用高通量測(cè)序?qū)σ捉咏D(zhuǎn)座酶核染色質(zhì)進(jìn)行分析的一種方法。通過(guò)高活性的Tn5轉(zhuǎn)座酶將測(cè)序接頭插入染色質(zhì)的開(kāi)放區(qū)域，然后通過(guò)測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)推斷染色質(zhì)區(qū)域的可接觸性，并計(jì)算轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和核小體的區(qū)域位置。ATAC-seq是目前用于研究基因組調(diào)控定位簡(jiǎn)單有效的方法。
本期小編將分享近期發(fā)表的3篇ATAC-seq相關(guān)前沿文獻(xiàn)。
前沿文獻(xiàn)一
ATAC-seq數(shù)據(jù)中含有大量線粒體DNA(mtDNA) reads，嚴(yán)重影響數(shù)據(jù)的有效比例和有效測(cè)序深度，使用經(jīng)典的ATAC-seq建庫(kù)測(cè)序方法，作者觀察到在K562細(xì)胞中比對(duì)到mtDNA reads比例在75%。
因此作者改進(jìn)了ATAC-seq建庫(kù)方法，以減少mtDNA污染：1)將裂解緩沖液中細(xì)胞裂解的時(shí)間從最初的10分鐘減少到5分鐘；2）直接進(jìn)行轉(zhuǎn)座反應(yīng)不引入加裂解緩沖液步驟。
這2種方法中，不使用裂解緩沖液裂解方法（no lysis buffer），顯著降低了mtDNA污染比例，僅18%，（可能是有助于線粒體核膜保持完整）。同時(shí)，增加了ATAC-seq和DNase-seq兩種方法在reads水平的一致性。后續(xù)研究中采用改進(jìn)的no lysis buffer方案進(jìn)行ATAC-seq建庫(kù)。
作者還探究了文庫(kù)/測(cè)序深度對(duì)揭示開(kāi)放染色質(zhì)區(qū)域的影響，高深度和中等深度的ATAC-seq鑒定了相似數(shù)量的peaks，而低深度則略微減少。具有生物學(xué)重復(fù)的低至中等深度25-50Mb reads文庫(kù)足以可靠地鑒定人細(xì)胞系中的開(kāi)放染色質(zhì)區(qū)域。
前人研究表明，DNase I酶以非隨機(jī)方式切割基因組DNA，不同序列具有不同的切割傾向，并且這種序列偏差對(duì)未經(jīng)校正的footprinting質(zhì)量有不利影響。作者發(fā)現(xiàn)ATAC-seq和DNase-seq具有不同的序列偏差，但推斷的足跡的位置基本上是一致的。
偏差校正對(duì)footprinting性能的影響，對(duì)于DNase-seq比對(duì)ATAC-seq更大。可以通過(guò)使用生物學(xué)重復(fù)來(lái)得到一致的footprinting，突出重復(fù)性評(píng)估的重要性。
前沿文獻(xiàn)二
CCCTC結(jié)合因子（CCCTC-binding factor，CTCF）在間期中形成拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域（TAD）和loop環(huán)中起關(guān)鍵作用。在有絲分裂期間，不存在TAD，但是細(xì)胞周期中如何動(dòng)態(tài)控制TAD形成尚不清楚。作者使用了4種不同的方法來(lái)闡明這個(gè)問(wèn)題：
1）使用5C技術(shù)，證實(shí)TAD和CTCF環(huán)很容易在間期檢測(cè)到，但在分裂前中期不存在。
2）ATAC-seq分析顯示CTCF位點(diǎn)顯示出大大降低的可及性，并且喪失了前中期CTCF footprinting，表明CTCF結(jié)合的喪失和結(jié)合基序周?chē)暮诵◇w陣列的重排。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在前中期仍然可以接近。
3）使用CUT&RUN測(cè)序直接證明了位點(diǎn)特異性CTCF結(jié)合的喪失。（CUT&RUN測(cè)序即靶標(biāo)切割和使用核酸酶釋放蛋白和靶DNA結(jié)合片段，將微核細(xì)胞核酸酶的抗體靶向控制切割與大規(guī)模平行DNA測(cè)序相結(jié)合，以鑒定DNA相關(guān)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。它可用于√確定位任何感興趣的蛋白質(zhì)的全局DNA結(jié)合位點(diǎn)。目前，ChIP-Seq是用于研究蛋白質(zhì)-DNA關(guān)系的常用技術(shù)，然而，它受到許多實(shí)際和經(jīng)濟(jì)限制，CUT&RUN測(cè)序則不受這些影響。）
4）活細(xì)胞成像技術(shù)，光漂白熒光恢復(fù)和單分子追蹤技術(shù)顯示幾乎所有CTCF染色質(zhì)結(jié)合都在分裂前中期丟失。
綜上，在前中期期間CTCF與CTCF位點(diǎn)結(jié)合的喪失以及CTCF基序周?chē)娜旧|(zhì)重排，并且cohesin喪失，將導(dǎo)致在有絲分裂期間觀察到的TAD和CTCF環(huán)的喪失，并揭示CTCF位點(diǎn)、關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)順式元件以及在蛋白因子結(jié)合和核小體定位中顯示細(xì)胞周期階段依賴性動(dòng)力學(xué)。
前沿文獻(xiàn)三
轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（Transcriptional regulatory networks，TRN）通過(guò)描述轉(zhuǎn)錄因子（TF）與其靶基因之間的相互作用提供對(duì)細(xì)胞行為的了解。ATAC-seq與TF motif分析相結(jié)合，提供了全基因組數(shù)百個(gè)TF的染色質(zhì)結(jié)合的間接證據(jù)。
作者提出了在哺乳動(dòng)物中進(jìn)行TRN推理的方法，使用ATAC-seq數(shù)據(jù)來(lái)改進(jìn)基因表達(dá)模型。在輔助性T細(xì)胞17（Th17）分化的背景下測(cè)試了該方法，產(chǎn)生新的ATAC-seq數(shù)據(jù)以補(bǔ)充現(xiàn)有的Th17基因組資源。新的TRN推理方法整合和擴(kuò)展之前的Th17 TRN，以整合所有Th17數(shù)據(jù)（基因表達(dá)、ATAC-seq、TF敲除和ChIP-seq）。
鑒于ATAC-seq的普及，其提供高分辨率TF結(jié)合圖譜和低樣品起始量要求，作者預(yù)計(jì)他們的TRN方法將改進(jìn)新哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中的TRN推斷，特別是在體內(nèi)，直接來(lái)自人和動(dòng)物模型的細(xì)胞。
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