《iScience》喜馬拉雅旱獺基因組揭示其缺氧和冷適應(yīng)機(jī)制【含文獻(xiàn)原文】

2018年12月20日，西安交通大學(xué)劉恩岐教授團(tuán)隊(duì)與北京百邁客生物科技有限公司合作，通過純二代測(cè)序技術(shù)完成了喜馬拉雅旱獺基因組組裝，獲得了喜馬拉雅旱獺完整基因組草圖，并對(duì)其冬眠及環(huán)境適應(yīng)性機(jī)制進(jìn)行深入研究，該研究成果刊登于Cell子刊iScience。喜馬拉雅旱獺基因組文章具體研究?jī)?nèi)容如下：

摘要

喜馬拉雅旱獺（喜馬拉雅土撥鼠）是一種冬眠哺乳動(dòng)物，棲息在喜馬拉雅山脈的高海拔地區(qū)。本研究成功組裝了喜馬拉雅旱獺基因組，組裝基因組大小2.47 G。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，喜馬拉雅旱獺與蒙古旱獺大約在198萬年前開始分化。旱獺在冬眠期間，與肝臟中脂肪酸代謝相關(guān)基因，參與補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化，以及腦干細(xì)胞的多能性途徑發(fā)生改變。兩個(gè)受選擇基因Slc25a14和ΨAamp，在旱獺低海拔和高海拔種群之間顯示出明顯的基因分型差異。作為假基因，ΨAamp可能具有生物活性，通過競(jìng)爭(zhēng)性miRNA結(jié)合影響Aamp的穩(wěn)定性。這些發(fā)現(xiàn)揭示了喜馬拉雅旱獺適應(yīng)極端環(huán)境的分子和遺傳基礎(chǔ)。

研究背景

喜馬拉雅旱獺（喜馬拉雅土撥鼠）是旱獺屬的一種大型松鼠，廣泛分布在印度，尼泊爾和巴基斯坦喜馬拉雅地區(qū)以及中國(guó)青藏高原的海拔1,900-5,000米處。青藏高原以其氣壓低，氣候寒冷，資源有限的極端環(huán)境而聞名。喜馬拉雅旱獺具有幾個(gè)獨(dú)特的生物學(xué)特征，如冬眠，深洞挖掘，厚皮毛和增大的體積，這可能與其對(duì)惡劣環(huán)境選擇壓力的演化相關(guān)。

許多野生動(dòng)物，如牦牛，藏羚羊和藏獒，棲息在青藏高原。這些野生動(dòng)物的高海拔適應(yīng)機(jī)制引起了廣大研究者極大的興趣，盡管不同物種經(jīng)歷了相似的選擇壓力，但可能涉及到不同的適應(yīng)途徑和相關(guān)基因。與其它高原地區(qū)的哺乳動(dòng)物不同，喜馬拉雅旱獺冬季在群體中冬眠，冬眠洞穴特別深，有些深度超過10米。哺乳動(dòng)物的冬眠是代謝抑制和休眠的季節(jié)性狀態(tài)，其特征在于體溫，新陳代謝，心率和氧消耗量的降低。喜馬拉雅旱獺在冬季面臨嚴(yán)重的缺氧和寒冷壓力。

本研究通過高深度測(cè)序成功組裝了雄性喜馬拉雅旱獺基因組，對(duì)來自高海拔和低海拔地區(qū)的20只喜馬拉雅旱獺和其它4只旱獺進(jìn)行重測(cè)序，并對(duì)冬眠/覺醒狀態(tài)的喜馬拉雅旱獺進(jìn)行RNA測(cè)序。本研究提供了有關(guān)高海拔適應(yīng)和冬眠遺傳機(jī)制的線索，同時(shí)基于喜馬拉雅旱獺的生物學(xué)研究為研究旱獺進(jìn)化，高地疾病，冷適應(yīng)性提供了寶貴的資源。

材料方法

●?材料

一只來自中國(guó)青海省西寧市的2歲雄性喜馬拉雅旱獺；

●?基因組denovo策略

二代小片段文庫（mean insert sizes: 180 bp和500 bp）和mate-end文庫（mean insert sizes: 3 Kb, 4 Kb, 5 Kb, 8 Kb, 10 Kb, 15 Kb和17 Kb）；Illumina HiSeq 4000；測(cè)序深度：~206x；

●?研究方法

基因組組裝注釋：

1.?基因組調(diào)研圖：Genome size = 21-mer number / 21-mer depth，JELLYFISH，預(yù)估基因組~2.33 Gb；

2.基因組組裝：ALLPATHS-LG；SSPACE；GapCloser(V1.12 for SOAP?de novo)?，組裝基因組~2.47 Gb，contigN50=80.46 Kb，scaffoldN50=1.50 Mb；

3.基因組完整性評(píng)估：a，轉(zhuǎn)錄組基因完整性預(yù)測(cè)（旱獺腎，胰腺，腎上腺，肝臟和大腦組織混合），Trinity，BLAT，97.90% unigenes支持組裝好的參考基因組；b，CEGs評(píng)估：CEGMAv.2.3，BLAT，完整性99.60%；c，BUSCO評(píng)估：BUSCOv1.22 (mammalia_odb9)，完整性88.34%；

4.重復(fù)序列注釋：采用同源預(yù)測(cè)和從頭預(yù)測(cè)的策略對(duì)喜馬拉雅旱獺基因組進(jìn)行重復(fù)序列預(yù)測(cè)，軟件包括Repeat Scout，LTR-FINDER，MITE和PILER，鑒定了~1.149 Gb重復(fù)序列，占旱獺基因組的46.5%，LINE和LTR分別占喜馬拉雅旱獺基因組的20.05％和9.22％；

5.非編碼RNA（ncRNA）預(yù)測(cè)：tRNA-scan-SE；miRBase(Release 21)；miRDeep2；

6.假基因預(yù)測(cè)：tBLASTN，GeneWise，鑒定出1,479個(gè)假基因；

7.蛋白質(zhì)編碼基因預(yù)測(cè)和功能注釋：利用從頭預(yù)測(cè)（Augustus），同源預(yù)測(cè)（人，鼠，兔，GeneWise和GeMoMa）及轉(zhuǎn)錄組預(yù)測(cè)（BLAT，PASA，TopHat，Cufflinks，Transdecoder），EVidence Modeler(EVM)，對(duì)喜馬拉雅旱獺蛋白編碼基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，共計(jì)預(yù)測(cè)了21,468個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，占整個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因集的99.38％；

8.基因組注釋質(zhì)量評(píng)估：通過比較喜馬拉雅旱獺基因組的蛋白質(zhì)編碼基因結(jié)構(gòu)特征與3個(gè)注釋好的基因組（人：GRCh38.p7;鼠：GRCm38.p4；兔：OryCun2.0），發(fā)現(xiàn)喜馬拉雅旱獺和其它物種非常相似，表明喜馬拉雅旱獺蛋白質(zhì)編碼基因集的具有很好的質(zhì)量。

比較基因組學(xué)分析：

1.?直系同源基因和旁系同源基因鑒定：treeFam，all-to-allBLASTP，MUSCLE，Mafft；

2.系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建與分化時(shí)間估算：利用15個(gè)物種（小鼠，大鼠，倉鼠，喜馬拉雅旱獺，松鼠，鼠兔，兔子，人類，黑猩猩，山羊，綿羊，牛，豬，驢和馬）的4,573個(gè)單拷貝直系同源基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，MUSCLE，phyML，分化時(shí)間估算PAML MCMCtree；

3.比較基因組學(xué)分析：Treefam，Cafe。

群體進(jìn)化分析：

1.群體選擇：旱獺4個(gè)種群（長(zhǎng)尾旱獺，蒙古旱獺，灰色旱獺和黃腹旱獺）進(jìn)行全基因組重測(cè)序，揭示旱獺群體進(jìn)化；為了進(jìn)一步揭示喜馬拉雅旱獺高原適應(yīng)性機(jī)制，本研究中選擇了20只個(gè)體，包括10只低海拔個(gè)體（8只雄性和2只雌性，中國(guó)青海～1900m處）和10只高海拔個(gè)體（5只雄性和5只雌性，中國(guó)青?！?500 m處），進(jìn)行全基因組重測(cè)序，測(cè)序深度：～10x；

2.SNP calling：BWA，samtools，Picard，GATK3.0，SnpEff；2.旱獺系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析：松鼠作為外群，構(gòu)建喜馬拉雅旱獺，灰色旱獺，黃腹旱獺，長(zhǎng)尾旱獺，蒙古旱獺和高山旱獺系統(tǒng)發(fā)育樹，MUSCLE(v3.349)，phyML，MCMCtree；

3.種群歷史動(dòng)態(tài)分析：5只旱獺和3種喜馬拉雅動(dòng)物（金色的金絲猴，牦牛和大熊貓），PSMC模型，Mummer3.0；

4.群體結(jié)構(gòu)和遺傳關(guān)系分析：PCA（EIGENSOFT6.0），Structure（Admixturev1.22）；

5.群體高原適應(yīng)性選擇分析：Fst，π；

6.群體受自然選擇區(qū)域分析：Ka/Ks，t-test；

7.Slc25a14蛋白的同源建模分析：Bio3D和PyMOL1.8；

8.ΨAamp進(jìn)化與插入時(shí)間分析：MEGA7.0，EMBOSSpackage (v6.6.0.0)。

RNA分析：

1.綁定ΨAamp的miRNAs分析：BLASTN；

2.RT-PCR分析；

3.差異表達(dá)基因分析：TopHat，Cufflinks。

研究結(jié)果

1）喜馬拉雅旱獺基因組組裝與注釋

采用全基因組鳥槍法（whole genome shotgun strategy）及二代測(cè)序（Illumina HiSeq 2500），測(cè)序了1只來自中國(guó)青海西寧的雄性喜馬拉雅旱獺，通過對(duì)構(gòu)建17個(gè)DNA文庫(paired-end?和mate-pair libraries)測(cè)序，共計(jì)利用了508.41 Gb高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因組de novo，基因組覆蓋度206x，組裝基因組大小~2.47 Gb，contig N50=80 kb，scaffold N50=1.5 Mb，進(jìn)一步驗(yàn)證了組裝基因組的完整性和z確性，喜馬拉雅旱獺重復(fù)序列含量約占基因組的46.52%（與人基因組相似，基因組重復(fù)序列占46.1%），喜馬拉雅旱獺與地松鼠有相似的GC含量和CpG頻率，在喜馬拉雅旱獺基因組中共計(jì)鑒定出4,905個(gè)非編碼RNAs和1,479個(gè)假基因，基于同源性預(yù)測(cè)，從頭預(yù)測(cè)和轉(zhuǎn)錄組預(yù)測(cè)結(jié)合的方法，預(yù)測(cè)了21,609個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，其中99.4％被功能注釋?；蚰Ｐ吞卣髋c模式動(dòng)物相似，表明喜馬拉雅旱獺基因組的高度z確性。

2）旱獺基因組進(jìn)化分析

為了確立喜馬拉雅旱獺系統(tǒng)發(fā)育地位，研究人員比較了喜馬拉雅旱獺與其它14種哺乳動(dòng)物的基因編碼序列，這些哺乳動(dòng)物跨越靈長(zhǎng)目，嚙齒目，兔形目，奇蹄目和偶蹄目。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示喜馬拉雅旱獺（Himalayan marmot）和地松鼠（ground squirrel）在同一個(gè)分支中（圖1A），這一結(jié)果與土撥鼠從地松鼠進(jìn)化而來的數(shù)據(jù)一致。喜馬拉雅旱獺和地松鼠之間的分歧時(shí)間估計(jì)約為980萬年前（圖1 A）。通過比較喜馬拉雅旱獺與人，小鼠和兔的蛋白質(zhì)序列，共鑒定了四種哺乳動(dòng)物共有的10,358個(gè)同源基因家族，及235個(gè)喜馬拉雅旱獺特有的基因家族，在這些基因家族中，與調(diào)控?cái)z食行為和脂肪酸代謝過程相關(guān)的基因家族顯著增多。每個(gè)基因家族的基因變異數(shù)作為與物種適應(yīng)性分化密切相關(guān)的的機(jī)制，通過與地松鼠比較，推斷出在喜馬拉雅旱獺中大量擴(kuò)張和收縮的基因家族分別有221和118個(gè)（圖1B）。擴(kuò)張的基因家族主要富集攝食行為相關(guān)的功能基因類別（GO：2000253，攝食行為的正調(diào)控; GO：0002021，嗅覺感知等），缺氧適應(yīng)（GO：0003300），心肌肥大; GO：0007596，凝血等）和能量代謝（GO：2000507，能量穩(wěn)態(tài)正調(diào)控等）?；诳焖龠M(jìn)化的基因經(jīng)過了正向選擇這一假設(shè)，本研究中共計(jì)鑒定了78個(gè)受正向選擇的基因（PSGs），這些PSGs被認(rèn)為是參與全身動(dòng)脈血壓調(diào)節(jié)功能類別（GO：0043281），G2 DNA損傷checkpoint（GO：0031572），甘油三酯代謝過程（GO：0006641）和心肌收縮（GO：0060048）等。喜馬拉雅土撥鼠中特定擴(kuò)張的基因家族和PSGs推斷出其在基因組水平上對(duì)惡劣環(huán)境的適應(yīng)性演化。

圖1、喜馬拉雅旱獺基因組進(jìn)化研究

3）旱獺種群分化與種群歷史動(dòng)態(tài)分析

為了在全基因組角度上闡述旱獺進(jìn)化的情景，研究人員收集了4種旱獺，包括蒙古旱獺（M. sibirica），灰色旱獺（M. baibacina），長(zhǎng)尾旱獺（M. caudate）和黃腹旱獺（M. flaviventris），并對(duì)每個(gè)個(gè)體進(jìn)行全基因組重測(cè)序，覆蓋度~10x（圖2 A）。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，喜馬拉雅旱獺和蒙古旱獺是姊妹種，其分化時(shí)間~1.98 MYA（圖2B），二者的雜合度相近（圖2 C）,然而，喜馬拉雅旱獺和蒙古旱獺的有效群體大?。?em>Ne）的歷史動(dòng)態(tài)趨勢(shì)顯示出完全不同的模式，表明它們對(duì)其特定棲息地的適應(yīng)是獨(dú)立發(fā)生的，并且這些適應(yīng)性涉及多方面的生物學(xué)問題，包括季節(jié)性，飲食習(xí)慣和社會(huì)行為。黃腹旱獺的雜合度高于其它旱獺（圖2 C），基于PSMC模型分析發(fā)現(xiàn)，其廣泛的分布和種群大小正好相符。出乎意料的是，基于全基因組序列和Y染色體基因序列的分析發(fā)現(xiàn)阿爾卑斯旱獺?Alpine marmot (M. Marmota)(~5.45 MYA)的分化早于黃腹旱獺，進(jìn)一步挑戰(zhàn)了旱獺可能起源于北美的爭(zhēng)論。

圖2、旱獺的地理位置，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和雜合度分析

后續(xù)利用PSMC模型來檢驗(yàn)4個(gè)“喜馬拉雅”物種的祖先群體的有效群體大小，包括喜馬拉雅旱獺，大熊貓，牦牛和仰鼻猴。在兩個(gè)*大的冰川期間，喜馬拉雅旱獺的有效群體大小（Ne）急劇下降：Xixiabangm冰期（XG，1.17~0.8 MYA）和Naynayxungla冰期（NG，0.78~0.50MYA）。在此期間，其它3個(gè)喜馬拉雅物種群體大小也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。隨后，與其它哺乳動(dòng)物相比，喜馬拉雅旱獺經(jīng)歷了更長(zhǎng)的瓶頸期，這可能是由于喜馬拉雅旱獺的體型相對(duì)較小。然而，喜馬拉雅旱獺的有效群體大?。?em>Ne）并未受到最后冰川最大值（LGM，?2萬年前）的嚴(yán)重影響，這表明喜馬拉雅旱獺已經(jīng)適應(yīng)了惡劣的環(huán)境。

4）喜馬拉雅旱獺冬眠機(jī)制的轉(zhuǎn)錄組分析

與其它高原哺乳動(dòng)物不同，喜馬拉雅旱獺在冬季冬眠。為了闡述旱獺冬眠的分子機(jī)制，研究人員分析了來自喜馬拉雅旱獺肝臟和大腦的RNA-seq數(shù)據(jù)，以表征在冬眠/覺醒周期中基因表達(dá)的變化。差異表達(dá)的基因（DEGs）顯著富集在肝臟中脂肪酸代謝，萜類骨架生物合成和初級(jí)膽汁酸生物合成的途徑（圖3 A）。并清楚地觀察到在冬眠狀態(tài)下，參與脂肪酸降解的基因的上調(diào)及參與脂肪酸合成的基因的下調(diào)，暗示了一個(gè)√確的脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)機(jī)制（圖3 B）。此外，還發(fā)現(xiàn)在覺醒狀態(tài)下，包含與藥物代謝相關(guān)的基因-細(xì)胞色素P450，氨基酸的生物合成和碳水化合物分解代謝相關(guān)基因的總體下調(diào)。

在腦部，差異表達(dá)基因（DEGs）主要富集于補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)途徑以及調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號(hào)傳導(dǎo)途徑等（圖3 C）。之前有研究指出，由于冬眠者的大腦暴露在接近冰點(diǎn)的溫度并且血流量減少，因此淤滯引起血栓的風(fēng)險(xiǎn)增加。研究人員觀察到參與補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)，細(xì)胞色素P450的異生素代謝和晝夜節(jié)律的基因的顯著下調(diào)。此外，最近的一項(xiàng)研究表明，與冬眠者iPSCs分化的神經(jīng)元保留了內(nèi)在的抗寒特征，調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號(hào)通路中的兩個(gè)主要轉(zhuǎn)錄因子Sox2和Myc在冬眠期間顯著上調(diào)（圖3 D），其維持干細(xì)胞的自我更新能力并保護(hù)腦部免受冷誘導(dǎo)的損傷。同時(shí)，在覺醒期間參與調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的基因（Lifr，Bmpr2和Acvr2b等）的激活（圖3 D）可以促進(jìn)干細(xì)胞分化以修復(fù)受損細(xì)胞。干細(xì)胞多能性的時(shí)序性調(diào)控可能是喜馬拉雅旱獺在極端環(huán)境脅迫下生存的一種顯著策略。

圖3、冬眠期差異表達(dá)基因分析

根據(jù)前期的研究，喜馬拉雅旱獺與地松鼠和黑熊有共同的途徑，包括脂質(zhì)和葡萄糖代謝，解毒，補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)，以及晝夜節(jié)律。然而，研究人員發(fā)現(xiàn)在這兩個(gè)冬眠者（地松鼠和黑熊）和喜馬拉雅旱獺之間存在一小部分預(yù)測(cè)的共有差異表達(dá)基因（DEGs）和反常表達(dá)模式基因。這些結(jié)果表明，喜馬拉雅旱獺可能利用多樣化的壞境適應(yīng)性策略在高度季節(jié)性或不可預(yù)測(cè)的環(huán)境中生存。

5）高原適應(yīng)性的遺傳進(jìn)化研究

為了更好地了解喜馬拉雅旱獺的高原適應(yīng)性機(jī)制，研究人員從極高海拔（海拔> 4,500 m，n = 10）和相對(duì)低海拔（<1,900 m，n = 10）收集了20只喜馬拉雅旱獺。研究人員首先測(cè)量了血液參數(shù)，發(fā)現(xiàn)與低海拔喜馬拉雅旱獺相比，高海拔喜馬拉雅旱獺的一些血液相關(guān)性狀，尤其是紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，血紅蛋白濃度和平均紅細(xì)胞體積顯著增加。接下來，對(duì)每個(gè)喜馬拉雅旱獺進(jìn)行了全基因組測(cè)序，并在喜馬拉雅旱獺基因組中搜索了具有高種群分化（Fst）和多樣性比率（q_p,low/q_{p, high}）的區(qū)域，最終鑒定了分布在喜馬拉雅土撥鼠基因組不同scaffolds?中的24.84 Mb受選擇的區(qū)域。這些區(qū)域含有383個(gè)功能基因，與非選擇性基因相比，這些基因具有更高的Ka / Ks值（P <0.01），主要功能類別包括“缺氧反應(yīng)”，“DNA修復(fù)”，“血管生成”，“心臟功能”，“脂肪酸代謝”，“細(xì)胞周期”，“發(fā)熱”和“鈣信號(hào)通路”。參與缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1），血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）或其它缺氧相關(guān)信號(hào)通路的10個(gè)功能基因，包括Slc25a14，Nox-1，Hmox1，Vegfr2，Atg16l2，Bex1，Ptgr2，Gprasp1，F(xiàn)am46d?和Chd3，在高海拔和低海拔群體之間顯示出明顯的基因分型差異（圖4 A）。在Slc25a14中發(fā)現(xiàn)了非同義替換（由Ser28取代Phe28，F(xiàn)28S），其顯示出*強(qiáng)的分化信號(hào)（FST = 0.73）（圖4 A和B）?；谕唇５腟lc25a14的三維結(jié)構(gòu)顯示，F(xiàn)28S替換發(fā)生在N末端的loop區(qū)域，并且由于氨基的電荷和極性的變化而增加其與相鄰的α-螺旋的距離（圖4 C）。為了進(jìn)一步評(píng)估這一變體的功能影響，研究人員將突變體Slc25a14與其在不同哺乳動(dòng)物中的直系同源基因進(jìn)行比對(duì)，并發(fā)現(xiàn)Phe28在比對(duì)的其它動(dòng)物中高度保守。該突變體功能影響的預(yù)測(cè)證明F28S取代是有害的，所有這些結(jié)果都表明F28S突變可能是高海拔群體Slc25a14選擇性清除的結(jié)果。為了推測(cè)旱獺高海拔適應(yīng)和冬眠的遺傳適應(yīng)性機(jī)制，研究人員在選擇性清除區(qū)域鑒定到了116個(gè)差異表達(dá)基因，在這些基因中，25個(gè)差異表達(dá)基因與HIF-1途徑相關(guān)，主要屬于DNA修復(fù)，血管生成，脂肪酸代謝，細(xì)胞凋亡/細(xì)胞周期和發(fā)熱的類別相關(guān)。在冬眠/覺醒周期中，大量選擇性清除基因具有差異表達(dá)，表明這兩種生物學(xué)過程之間存在共同的遺傳影響（圖4 D）。在這些基因中，Bex1, Apln, kcne1l, Med12, Dad1和Fgf16在冬眠階段肝臟或腦中顯著上調(diào)（圖4 D），進(jìn)一步證明這些基因參與冬眠和高原適應(yīng)性，先前的研究報(bào)道了這些基因參與許多生理過程，包括神經(jīng)元分化，肝再生，血管生成和能量代謝，而這需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖4、高海拔喜馬拉雅旱獺的群體選擇和冬眠期間差異表達(dá)基因的重疊分析

6）ΨAamp在旱獺高海拔適應(yīng)中的演化和潛在作用

假基因逐漸被認(rèn)定為是適應(yīng)性表型多樣化的重要調(diào)節(jié)因子，與選擇性清除信號(hào)相關(guān)，研究人員鑒定了27個(gè)參與極高海拔適應(yīng)的候選假基因，占全基因組范圍內(nèi)假基因的1.83％。這一比率幾乎與具有1.78％的功能基因的比率相當(dāng)，表明它們?cè)跇O端環(huán)境的適應(yīng)性中的作用不可忽略。與蛋白質(zhì)編碼基因中發(fā)現(xiàn)的群體基因型差異一致，研究人員在高海拔群體中觀察到受選擇的假基因中幾乎固定的突變，例如ΨAamp，ΨAdl1和ΨRnf114。在這些假基因中，血管相關(guān)的遷移細(xì)胞蛋白假基因（ΨAamp）具有完整的基因結(jié)構(gòu)并顯示出*高的F_st值（Fst = 0.67），但ΨAamp未被檢測(cè)為受選擇性基因（圖4 A和5 A）。ΨAamp的結(jié)構(gòu)顯示它是一個(gè)整合的加工假基因，其mRNA通過逆轉(zhuǎn)錄被插入基因組中（圖5 B）。這個(gè)假基因含有過早終止密碼子（第208個(gè)核苷酸，C> T），缺失/插入和移碼突變，使其不能翻譯成功能性的蛋白，Aamp和ΨAamp的共線性分析表明在不同哺乳動(dòng)物中Aamp是高度保守的。然而，在地松鼠和喜馬拉雅旱獺中發(fā)現(xiàn)并保存了高度保守的共線性位點(diǎn)（圖5 B），進(jìn)一步的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，ΨAamp和Aamp屬于兩個(gè)獨(dú)立的分支，基于序列分歧插入時(shí)間的估算暗示假基因的插入事件發(fā)生在約22.64~25.40 MYA，在喜馬拉雅旱獺和地松鼠分化之前（圖?5 C）。這些發(fā)現(xiàn)支持古老的假基因?qū)τ谒墒缶哂刑禺愋圆墓餐淖嫦冗z傳而來這一假設(shè)，然而，與地松鼠相比，喜馬拉雅旱獺顯示Aamp和ΨAamp之間的序列距離較小，這表明存在選擇性壓力來維持旱獺的遺傳元素。

圖5、ΨAamp高海拔適應(yīng)性中的演化和潛在作用

作為重要的調(diào)節(jié)區(qū)域，3’UTR是動(dòng)物中經(jīng)典的靶向miRNA基因座，該區(qū)域的突變可能影響mRNA豐度和表型分化，在高海拔的群體中上游區(qū)域，研究人員發(fā)現(xiàn)了2^nd外顯子,?11^th外顯子、ΨAamp的3’UTR區(qū)中的4個(gè)固定的替代（圖5 D），在3’UTR區(qū)內(nèi)，發(fā)現(xiàn)了完全保守的匹配，其跨越T> C替換，對(duì)于ΨAamp/ Aamp-靶向hsa-miR-6739-5p和mmu-miR-6935-3p（圖5 E）。Pre-miRNA結(jié)構(gòu)模擬顯示它們?cè)谙柴R拉雅旱獺基因組中具有穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu)（圖5 E），此外，在喜馬拉雅旱獺肝臟中檢測(cè)到了ΨAamp和?Aamp的轉(zhuǎn)錄。在高海拔的群體中Aamp的表達(dá)水平降低。這些結(jié)果支持這樣的假設(shè)：ΨAamp中?3’UTR區(qū)的突變可能降低miRNA組合效率，從而影響Aamp在高海拔群體中的穩(wěn)定性。

討論

在本研究中，成功組裝了一只雄性喜馬拉雅旱獺基因組草圖，為研究其基因組進(jìn)化和獨(dú)特的生理特征提供了寶貴的基因組資源，包括缺氧適應(yīng)和能量穩(wěn)態(tài)。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，喜馬拉雅旱獺的形成可能是由于青藏高原的隆起造成的。在最后一次冰川季期間，喜馬拉雅旱獺很好地適應(yīng)了極端環(huán)境。

對(duì)高海拔和低海拔群體的遺傳多樣性有了更深入的了解，豐富了哺乳動(dòng)物極端環(huán)境適應(yīng)性的認(rèn)知。在Slc25a14基因座處發(fā)現(xiàn)的強(qiáng)烈的群體分化信號(hào)和明顯的基因型差異意味著其在喜馬拉雅旱獺對(duì)缺氧的適應(yīng)性反應(yīng)中起到了重要的作用，Slc25a14通過調(diào)節(jié)線粒體功能和氧化劑產(chǎn)生具有神經(jīng)保護(hù)作用，同時(shí)還涉及維持代謝率和適應(yīng)性體溫調(diào)節(jié)。有趣的是，研究人員發(fā)現(xiàn)ΨAamp在高海拔群體中通過競(jìng)爭(zhēng)性miRNA介導(dǎo)Aamp表達(dá)可能具有生物學(xué)活性，Aamp以多種細(xì)胞類型表達(dá)，主要定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和膜中。Aamp的敲除損害了VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成，高海拔群體中Aamp的下調(diào)可能是在極度缺氧條件下防止過度血管生成的保護(hù)性策略。由于喜馬拉雅旱獺是一種冬眠動(dòng)物，高比例的受選擇基因的篩選支持了高原適應(yīng)性和冬眠之間的密切聯(lián)系，這些基因在冬眠/覺醒周期中差異表達(dá)。與此同時(shí)，干細(xì)胞信號(hào)通路的補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)和多能性可能與大腦的抗寒性保護(hù)策略有關(guān)。

喜馬拉雅旱獺基因組的特征及本文提供的其它旱獺的全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)為闡明其進(jìn)化事件和環(huán)境適應(yīng)性提供了廣泛的視角。其獨(dú)特遺傳特征的鑒定將有助于其潛在的醫(yī)學(xué)應(yīng)用。

 

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