快速克隆基因（三）

上一篇文章與大家分享了Positionalcloning 2.0?怎樣避免在基因克隆上花費(fèi)10年？隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，“核酸”檢測手段越來越精準(zhǔn)，百邁客自2009年成立以來，一直與大家一起目睹此過程并不斷成長，基于高通量測序平臺和博士為主的研發(fā)團(tuán)隊(duì)，開展了對群體、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、醫(yī)學(xué)、基因組、微生物等研究的主體業(yè)務(wù)：

??當(dāng)基因組檢測不是制約基因克隆的主要問題，表型鑒定逐步演變?yōu)榛蚩寺〉男缕款i。

在過去幾年，基因組在基因克隆方面的飛速進(jìn)展，基于突變體，涌現(xiàn)出快速且低成本的基因定位方法。也迎來：如何在成千個(gè)突變材料中將感興趣的表型植株挑選出來的挑戰(zhàn)。同時(shí)，基因功能的冗余也為多倍體篩選突變體造成一定阻力，一般一個(gè)基因在植株中作用明顯，突變后產(chǎn)生的表型差異越大，這樣的會容易被鑒定。而很多重要的農(nóng)藝性狀，例如谷物產(chǎn)量，耐旱性或抗病性等屬于數(shù)量性狀，由很多微效位點(diǎn)一起加效起作用，如果表型還和環(huán)境存在互作，這些無外乎都對去尋找它們的突變體克隆基因形成了障礙。例如Lr34，Lr46和Lr68是植物中抗葉銹病相關(guān)基因，在世界大多數(shù)地方，Lr34和Lr46比Lr68有更大的表型效應(yīng)，而在烏拉圭和阿根廷，Lr68表現(xiàn)出三者間最強(qiáng)的表型效應(yīng)，所以在克隆Lr68時(shí)要考慮環(huán)境對表型影響。理論上，合適的環(huán)境中的表型考查，可以將目標(biāo)QTL的貢獻(xiàn)率提到最大化。

過去的十年中，測序，基因組復(fù)雜性降低，標(biāo)記開發(fā)和基因組分析加速了谷物基因的克隆。同時(shí)表型檢測系統(tǒng)也有了較快的發(fā)展，可以綜合自動化控制、光學(xué)成像、圖像分析及計(jì)算機(jī)技術(shù)等多種現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，表型組學(xué)研究可追蹤分析基因型、環(huán)境與表型的關(guān)系?；趫D像技術(shù)，可在穩(wěn)定一致的環(huán)境下，定量，準(zhǔn)確，無損地獲取植株表型，除了可對產(chǎn)量、抗性等復(fù)雜性狀進(jìn)行動態(tài)測量外，還可獲得人工無法測量的新性狀如植株密度、谷粒投影面積等，另外隨著代謝組的發(fā)展，也為我們帶來了形形色色的表型數(shù)據(jù)。

??基因克隆，未來何去何從？

隨著谷物基因組的發(fā)布，基因組學(xué)研究最終走向后基因組時(shí)代，大米，高粱，玉米，大麥和小麥的基因組被公布，這為開發(fā)分子標(biāo)記，進(jìn)行圖位克隆提供便利，下個(gè)目標(biāo)將會是綜合的分析不同種質(zhì)資源間的變異，包括單核苷酸變異，拷貝數(shù)變異，和結(jié)構(gòu)重組等。舉個(gè)例子，2018年高質(zhì)量的野生稻和栽培稻的基因組、3000份水稻重測序被公布，這是水稻中首次基于上千份品種的基因序列多樣性及結(jié)構(gòu)研究。類似的研究在小麥和大麥中開展，基于整個(gè)品種的變異檢測，可以用于TILLING群體或MutRenSeq的測序的捕獲序列設(shè)計(jì)，另外，數(shù)以千份的的重測序數(shù)據(jù)將更有利于GWAS研究，例如：Arora等選取174Ae. tauschii ssp.strangulata材料和21份Ae. tauschii ssp. tauschii材料，基于AgRenSeq的K-mer分析，成功地鑒定出了Sr33，Sr45，Sr46和SrTA1662基因。

另外，可以預(yù)期的是測序技術(shù)的讀長和準(zhǔn)確性在不久的將來會進(jìn)一步改進(jìn)，例如，最近擬南芥的高質(zhì)量基因組公布，利用MinIONNanopore組裝出包含62個(gè)contigs，N50為12.3Mb，總長為111Mb基因組且大大降低測序成本，百邁客全新引進(jìn)2臺ONT高通量測序儀PromethIONNanopore結(jié)果也是杠杠的：

PromethION下機(jī)數(shù)據(jù)（部分）

注：Species：分析的物種信息；SeqNum：各個(gè)長度范圍內(nèi)序列的數(shù)目；SumBase：指各個(gè)長度范圍內(nèi)序列的總長度；N50Len：reads N50長度；N90Len：readsN90長度；MeanLen：平均reads長度；MaxLen：最長reads長度；MeanQual：質(zhì)量值。

我們前期的研究主要基于孟德爾遺傳定律，大多涉及的是質(zhì)量性狀和數(shù)量性狀的主效位點(diǎn)，而好多重要的農(nóng)藝性狀如產(chǎn)量及花期，微效QTL及它們間的互作發(fā)揮了重要作用，當(dāng)然，在前期做完QTL或GWAS研究之后，圖位克隆仍是定位數(shù)量性狀相關(guān)基因的方法。

例如，GWAS和圖位克隆的組合，定位水稻中的抗性基因bsr-d1。微效基因的克隆障礙主要因?yàn)樗鼈儗Ρ硇偷呢暙I(xiàn)率較小，這樣基于極端表型和突變體的MutMap或MutChromSeq方法并不適合于它，后期相關(guān)基因的克隆絕大部分取決于精準(zhǔn)的表型鑒定。

總之，在過去5年里，基因組研究的進(jìn)步徹底改變了基因克隆的時(shí)速，一個(gè)全面的克隆基因的目錄，以及它們功能多態(tài)性，可以大大提高基因組輔助育種的準(zhǔn)確性。

 

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