從1977年第一代測(cè)序技術(shù)的問(wèn)世，發(fā)展至今已有四十余年，這幾十年間，測(cè)序技術(shù)的發(fā)展突飛猛進(jìn)，從一代到二代再到三代，每一步突破都是測(cè)序行業(yè)一次質(zhì)的飛躍。三代測(cè)序以PacBio公司的SMRT測(cè)序技術(shù)為代表，測(cè)序過(guò)程無(wú)需PCR擴(kuò)增，再加上三代測(cè)序長(zhǎng)讀長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)，無(wú)需組裝，可以直接獲得從5’端到3’端高質(zhì)量的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組信息，可準(zhǔn)確鑒定基因的可變剪接、APA（可選擇性多聚腺苷酸化）、融合基因、基因家族和非編碼RNA等信息。百邁客2016年率先引進(jìn)三代測(cè)序平臺(tái)PacBio RSⅡ和PacBio Sequel，至今已積累了豐富的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)，無(wú)論實(shí)驗(yàn)?zāi)芰€是信息分析能力都達(dá)到行業(yè)較高水平。一定不是小編吹噓，咱們用事（案）實(shí)（例）說(shuō)話。
案例一：
Identification and analysis of glutathione S-transferase gene family in sweet potato reveal divergent GST-mediated networks in aboveground and underground tissues in response to abiotic stresses通過(guò)鑒定和分析谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶基因家族揭示甘薯地上和地下組織響應(yīng)非生物脅迫中的GST介導(dǎo)的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制
發(fā)表雜志：BMC Plant Biology
影響因子：3.964
發(fā)表時(shí)間：2017
實(shí)驗(yàn)材料：甘薯
測(cè)序方法：2+3聯(lián)合測(cè)序
文章概述：基因重復(fù)是物種進(jìn)化研究的重要內(nèi)容之一?；蛑貜?fù)可以導(dǎo)致基因在編碼蛋白以及表達(dá)量上的多樣性，并最終導(dǎo)致明顯的功能分化。某個(gè)基因家族可能是由同一個(gè)祖先（全基因組或單個(gè)基因）通過(guò)基因重復(fù)分化而來(lái)。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）是一類基因家族，其廣泛真核生物和原核生物中。GST基因可以參與到生物體響應(yīng)非生物脅迫中（如臭氧、過(guò)氧化氫、植物激素、重金屬、熱激、干旱等）。甘薯是六倍體物種，其復(fù)雜的遺傳背景被認(rèn)為是多個(gè)物種的全基因組重復(fù)形成的。本文通過(guò)2+3轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)進(jìn)行基因家族分析。發(fā)現(xiàn)GST基因廣泛參與甘薯的非生物脅迫相應(yīng)中，且層次聚類分析表明GST基因的在甘薯地上和地下組織中響應(yīng)非生物脅迫的表達(dá)模式明顯不同。
圖1. 甘薯、野生甘薯、擬南芥、牽?；℅ST蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)
案例二
SMRT sequencing of full-length transcriptome of flea beetle Agasicles hygrophila (Selman and Vogt)
蓮草直胸跳甲全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組分析
發(fā)表雜志：Scientific reports
影響因子：4.259
發(fā)表時(shí)間：2018年1月
實(shí)驗(yàn)材料：蓮草直胸跳甲
測(cè)序方法：2+3聯(lián)合測(cè)序
文章概述：空心蓮子草Alternanthera philoxeroides (Mart.) (Amaranthaceae)是多年生雜草，原產(chǎn)于南美洲，20世紀(jì)30年代傳入我國(guó)。在中國(guó)空心蓮子草被認(rèn)為是一種重要入侵物種，并且嚴(yán)重影響了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境。蓮草直胸跳甲Agasicles hygrophila是空心蓮子草的專性天敵，作為生物防治手段而被引入。目前，蓮草直胸跳甲的基因組和轉(zhuǎn)錄組信息尚未被研究，因此在本研究中作者對(duì)其進(jìn)行了全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得較完整的轉(zhuǎn)錄本集合，預(yù)測(cè)了145個(gè)可變剪接事件；27,318條簡(jiǎn)單重復(fù)序列，經(jīng)TransDecoder鑒定獲得24,040個(gè)ORF，其中有16,205個(gè)完整的ORF；預(yù)測(cè)得到4,198 個(gè)lncRNA，為進(jìn)一步研究蓮草直胸跳甲與宿主植物和生態(tài)系統(tǒng)之間相互作用的分子機(jī)制提供了很好的遺傳信息基礎(chǔ)。
圖2. 蓮草直胸跳甲轉(zhuǎn)錄本的GO功能注釋
案例三
Generation and comparative analysis of full-length transcriptomes in sweetpotato and its putative wild ancestor I. trifida甘薯及野生型甘薯的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組比較分析
發(fā)表雜志：暫無(wú)開(kāi)源期刊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室在線發(fā)表
發(fā)表時(shí)間：2017年3月
實(shí)驗(yàn)材料：甘薯和野生甘薯
測(cè)序方法：2+3聯(lián)合測(cè)序
文章概述：甘薯是許多發(fā)展中國(guó)家最重要的作物之一，也是重要的能量來(lái)源。然而，甘薯是同源六倍體植物，基因組大小約3-4G，目前還沒(méi)有高質(zhì)量的參考基因組。此外，甘薯基因組的雜合度高，目前還沒(méi)有關(guān)于甘薯正向遺傳學(xué)研究的報(bào)道。目前，沒(méi)有獲得大規(guī)模的全長(zhǎng)cDNA序列阻礙了甘薯功能基因組學(xué)和分子育種研究的進(jìn)展。長(zhǎng)期以來(lái)，人們一直認(rèn)為甘薯最有可能由二倍體祖先野生甘薯（I. trifida）進(jìn)化而來(lái)，但是沒(méi)有確鑿的證據(jù)。該研究通過(guò)2+3聯(lián)合測(cè)序的方法獲得甘薯和野生甘薯的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，揭示二者的進(jìn)化關(guān)系。甘薯和野生甘薯大多數(shù)的轉(zhuǎn)錄本都是同源的，并且確定了1269個(gè)假定的甘薯和野生甘薯之間的同源基因?qū)?，通過(guò)Ka/Ks比值分析，只有56個(gè)基因?qū)Φ腒a/Ks比值大于1，表明在甘薯的進(jìn)化或馴化過(guò)程中，大多數(shù)基因都是受到純化選擇的。
圖3. 在甘薯（Ib53861）和野生甘薯（It51184）中的53,861個(gè)非冗余轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量和長(zhǎng)度分布。
案例四
A transcriptome atlas of rabbit revealed by PacBio single-molecule long-read sequencing通過(guò)PacBio單分子長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)揭示家兔轉(zhuǎn)錄本圖譜
發(fā)表雜志：Scientific reports
影響因子：4.25
發(fā)表時(shí)間：2017
實(shí)驗(yàn)材料：兔子
測(cè)序方法：2+3聯(lián)合測(cè)序
文章概述：兔子（Oryctolagus cuniculus），是重要的哺乳動(dòng)物，由于其與人類系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系密切，并且具有生命周期短、性格溫順等特點(diǎn)，因此在生物醫(yī)學(xué)研究中將兔子作為模式動(dòng)物。兔子的基因組大小為2.66Gb，從Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到22，668個(gè)基因位點(diǎn)包括了24,946個(gè)轉(zhuǎn)錄本，但是其中的大部分只是預(yù)測(cè)，不同的isoforms和非翻譯區(qū)還缺少可靠的注釋，對(duì)復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄本評(píng)估不準(zhǔn)確，通過(guò)高通量測(cè)序的方法可以較好的研究轉(zhuǎn)錄本、isoforms和基因表達(dá)水平，但是由于二代測(cè)序的短讀長(zhǎng)很難獲得轉(zhuǎn)錄本全長(zhǎng)，研究可變剪接和APA事件就成為問(wèn)題，本研究利用PacBio三代測(cè)序平臺(tái)，共鑒定到多達(dá)24,797個(gè)AS事件和11,184個(gè)APA事件，提供了一整套全面的轉(zhuǎn)錄本參考數(shù)據(jù)集，用于繪制兔的轉(zhuǎn)錄本圖譜。對(duì)于改進(jìn)兔基因組的注釋有較大幫助。
Figure 4.基因通過(guò)PacBio所測(cè)轉(zhuǎn)錄本和組裝得到的轉(zhuǎn)錄本還原10個(gè)MHC基因。染色體定位、命名和每個(gè)基因的Ensembl編號(hào)（在左側(cè)）
我們都知道好的測(cè)序數(shù)據(jù)要配上專業(yè)的分析團(tuán)隊(duì)才能讓故事敘述的更加完美，百邁客研發(fā)團(tuán)隊(duì)于2018年5月在之前的分析基礎(chǔ)上新增了一些分析條目，讓您的數(shù)據(jù)抒寫更華麗的篇章（如下表）。
百邁客新增分析服務(wù)表
| 標(biāo)準(zhǔn)分析（有參為例） | 新增分析內(nèi)容 | 新增分析圖 |
|---|---|---|
| 1.測(cè)序Reads質(zhì)量質(zhì)控（QV）； | 1.分析轉(zhuǎn)錄本和基因的關(guān)系（無(wú)參全長(zhǎng)） | 1.染色體 |
| 2.全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本評(píng)估； | 2.全長(zhǎng)序列的完整性評(píng)估 | 2.基因組中基因的密度熱圖 |
| 3.Isoform序列聚類； | 3.轉(zhuǎn)錄因子分析 | 3.三代測(cè)序結(jié)果中測(cè)到的基因的密度熱圖 |
| 4.轉(zhuǎn)錄本去冗余； | 4.可變剪切分析結(jié)果可視化 | 4.基因組中轉(zhuǎn)錄本的密度熱圖 |
| 5.與參考基因組進(jìn)行比對(duì) | 5.等位基因分析（有參全長(zhǎng)） | 5.三代測(cè)序結(jié)果中測(cè)到的轉(zhuǎn)錄本的密度熱圖 |
| 6.基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化； | 6.SNP分析（無(wú)參） | 6.所有差異轉(zhuǎn)錄本在染色體上的分布密度直方圖 |
| 7.新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)； | 7.APA上下游堿基分布及motif分析 | 7.LncRNA在染色體上的分布密度直方圖 |
| 8.可變剪接分析； | 8.差異可變剪切 | 8.融合轉(zhuǎn)錄本連線圖 |
| 9.轉(zhuǎn)錄本功能注釋； | 9.circos圖展示 | |
| 10.融合轉(zhuǎn)錄本分析； | ||
| 11.基因家族分析； | ||
| 12.lncRNA預(yù)測(cè)； | ||
| 13.lncRNA靶基因預(yù)測(cè)； | ||
| 14.SSR分析； | ||
| 15.CDS預(yù)測(cè)； | ||
| 16.可變多聚腺苷酸化分析（APA）； | ||
| 17.不同樣品可變剪接差異對(duì)比（兩個(gè)或以上樣品）； | ||
| 18.不同樣品融合轉(zhuǎn)錄本差異對(duì)比（兩個(gè)或以上樣品）； | ||
| 19.不同樣品可變多聚腺苷酸化（APA）差異對(duì)比（兩個(gè)或以上樣品） |
百邁客全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組分析流程圖：
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