一文帶你get Hi-C研究套路

背景介紹

DNA在染色體上是高度折疊的，DNA與DNA片段之間不可避免的形成了高強(qiáng)度的交互作用。2002年提出的3C技術(shù)，用于測(cè)定染色體特定位點(diǎn)與位點(diǎn)之間的交互作用，隨后發(fā)展出4C、5C 技術(shù)，分別用于測(cè)定染色體上一點(diǎn)到多點(diǎn)和多點(diǎn)與多點(diǎn)之間的交互作用。Job Dekker在2009年開發(fā)出Hi-C 技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了全基因組范圍內(nèi)染色體片段間相互作用的捕獲。Hi-C 除了用于輔助基因組組裝、對(duì)已組裝的基因組進(jìn)行糾錯(cuò)，還可以揭示基因組的三維結(jié)構(gòu)特征，包括從隔室（A/B Compartments）到拓?fù)湎嚓P(guān)結(jié)構(gòu)域（TAD），最后到染色體環(huán)（loop），目前，已在人、果蠅、酵母、擬南芥、水稻和棉花等物種成功構(gòu)建基因組三維結(jié)構(gòu)，并完成了對(duì)不同樣本基因組三維結(jié)構(gòu)的比較分析。

1、Hi-C三維構(gòu)象研究?jī)?nèi)容

1）繪制全基因組的Hi-C map、Cis/Trans和IDEs等分析；
2）Compartment A/B 鑒定與分析，包括與ChIP-seq、WGBS和RNAseq等聯(lián)合分析；
3）TAD鑒定與分析，包括與ChIP-seq、WGBS和RNAseq等聯(lián)合分析；
4）繪制全基因組LOOP模型圖，需DNase-seq或ATAC-seq，并與ChIP-seq和RNAseq聯(lián)合分析；
5）多樣本三維結(jié)構(gòu)差異分析，包括Compartment A/B、TAD和Loop差異鑒定與分析；
6）基因/重復(fù)序列互作分析，包括與RNAseq聯(lián)合分析。

圖1 染色體不同層級(jí)三維構(gòu)象圖
（Fraser J, et al, 2015）

2、染色體三維結(jié)構(gòu)重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容

A/B compartments

高等動(dòng)植物基因組可以人為劃分為兩個(gè)compartments，稱作A/B compartments，通過計(jì)算PCA，第一主成分中正值表示A compartment，負(fù)值表示B compartment。A/B compartments在基因組中一般呈間隔分布，A compartments呈松散染色質(zhì)狀態(tài)，基因密度高，屬于轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域，而B compartments則呈壓縮染色質(zhì)狀態(tài)，基因密度低，屬于轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)域。通過對(duì)多個(gè)樣本A/B compartments 的分布進(jìn)行對(duì)比，在全基因組水平找出A/B compartments保守的區(qū)域以及發(fā)生A/B compartments轉(zhuǎn)換的區(qū)域，結(jié)合RNA-Seq對(duì)發(fā)生A/B compartments轉(zhuǎn)換區(qū)域內(nèi)的基因的表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有助于解釋不同樣本間的差異與染色質(zhì)活性狀態(tài)之間的關(guān)系。如圖2：

圖2 人正常細(xì)胞和癌癥細(xì)胞A/B compartments
（Wu P, et al, 2017）

例如在人的多發(fā)性骨髓瘤文章中，作者利用正常B細(xì)胞（GM12878）和兩種亞型的骨髓瘤細(xì)胞（近二倍體U266和近三倍體RPMI-8226）進(jìn)行Hi-C、WGS和RNA-seq測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于GM12878，U266和RPMI-8226癌癥細(xì)胞中6%的區(qū)域均存在B轉(zhuǎn)換到A，1%的區(qū)域均存在A轉(zhuǎn)換到B，結(jié)合RNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)B轉(zhuǎn)換到A區(qū)域內(nèi)的基因變成轉(zhuǎn)錄活躍狀態(tài)，而A轉(zhuǎn)換到B區(qū)域內(nèi)的基因變成轉(zhuǎn)錄抑制狀態(tài)，KEGG富集通路發(fā)現(xiàn)這些基因與多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)，主要涉及MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、TNF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體相互作用途徑等，進(jìn)一步在染色體2q11.2-q12.142處發(fā)現(xiàn)一個(gè)細(xì)胞因子基因簇，幾種白細(xì)胞介素IL1R1，IL1R2，IL18R1和細(xì)胞因子MAP4K4下調(diào)表達(dá)，這些基因在后續(xù)研究中重點(diǎn)關(guān)注。

?TAD?

TAD（拓?fù)潢P(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域）是一個(gè)高度自關(guān)聯(lián)的連續(xù)區(qū)域，通過明顯的邊界與相鄰區(qū)域分離開來，形成一個(gè)獨(dú)立的調(diào)控單元，內(nèi)部的基因擁有共同的調(diào)控元件，存在協(xié)同表達(dá)特征。TAD邊界通常具有大量的絕緣子蛋白和黏連蛋白（植物中TAD邊界一般缺少絕緣蛋白，邊界不明顯），對(duì)于維持TAD結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性具有重要作用，不但可以指導(dǎo)染色體折疊成高級(jí)結(jié)構(gòu)，還可以正確指導(dǎo)遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)錄調(diào)控，該邊界發(fā)生變化會(huì)導(dǎo)致基因調(diào)控變得紊亂。TAD邊界還與組蛋白修飾、甲基化修飾等密切相關(guān)，通常與轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)的表觀遺傳標(biāo)記富集在TAD邊界，而與轉(zhuǎn)錄失活相關(guān)的表觀遺傳標(biāo)記遠(yuǎn)離TAD邊界。通過對(duì)多個(gè)樣本TAD進(jìn)行對(duì)比，在全基因組水平找出發(fā)生變化的TAD（重點(diǎn)關(guān)注TAD邊界），結(jié)合ChIP-seq、WGBS等分析TAD的變化是否與表觀遺傳修飾相關(guān)，進(jìn)一步利用RNA-Seq對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有助于解釋不同樣本間空間結(jié)構(gòu)的差異與表觀遺傳修飾及轉(zhuǎn)錄調(diào)控之間的關(guān)系。如圖3：

圖3 不同種棉花TAD邊界及表觀遺傳修飾
（Wang M, et al, 2018）

例如，在棉花的三維基因組進(jìn)化文章中，作者對(duì)二倍體雷蒙德氏棉、二倍體亞洲棉、四倍體陸地棉和四倍體海島棉構(gòu)建了三維基因組圖譜，與雷蒙德氏棉D(zhuǎn)03染色體相比，陸地棉和海島棉對(duì)應(yīng)的Ｄ亞基因組中發(fā)生了染色質(zhì)重排，虛線對(duì)應(yīng)的TAD結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，雷蒙德氏棉中該TAD結(jié)構(gòu)完整，存在明顯的邊界，陸地棉中該邊界發(fā)生了左移，而海島棉中該TAD趨向于消失。因而通過鑒定TAD發(fā)生變化區(qū)域的基因，可以研究多倍化過程中基因表達(dá)調(diào)控的改變（研究多倍體的老師們，這可是一個(gè)很好的套路文章哦）。同時(shí)結(jié)合ChIP-seq數(shù)據(jù)對(duì)該TAD邊界進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，雷蒙德氏棉富含豐富的H3K4me3（活性染色質(zhì)標(biāo)記），而陸地棉和海島棉中H3K4me3顯著減少，說明在棉花的多倍化與表觀遺傳修飾存在密切關(guān)聯(lián)。

Loop?

Loop（染色質(zhì)環(huán)）將線性距離很遠(yuǎn)的位點(diǎn)拉至空間距離很近，在Hi-C圖譜中表現(xiàn)為峰值位點(diǎn)（peak loci），該peak位點(diǎn)通常一端為啟動(dòng)子，另一端為增強(qiáng)子，Loop將啟動(dòng)子和增強(qiáng)子拉至空間很近的距離，從而調(diào)控基因的表達(dá)，存在這種loop（啟動(dòng)子-增強(qiáng)子環(huán)）相關(guān)基因的表達(dá)量將幾倍甚至幾十倍的增加。loop通常與DNAase-seq或者ATAC-seq結(jié)合使用（特異性識(shí)別啟動(dòng)子），從而鑒定啟動(dòng)子-增強(qiáng)子環(huán)。通過對(duì)多個(gè)樣本Loop進(jìn)行對(duì)比，在全基因組水平找出發(fā)生變化的Loop，結(jié)RNA-Seq對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有助于解釋不同樣本間loop及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控之間的關(guān)系。如圖4：

圖4 人不同細(xì)胞loop（Rao S S.P. , et al, 2014）

例如，在人的loop文章中，作者在GM12878細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)9448個(gè)loop，其中2854個(gè)loop與已知的啟動(dòng)子-增強(qiáng)子作用相關(guān)，基因的啟動(dòng)子存在loop比不存在loop時(shí)的表達(dá)量顯著增加。GM12878細(xì)胞系中存在一個(gè)Loop，這個(gè)Loop連接了SELL啟動(dòng)子和一個(gè)遠(yuǎn)端增強(qiáng)子SELP，基因開啟轉(zhuǎn)錄，表達(dá)量增加，而IMR90細(xì)胞系中沒有這個(gè)Loop，基因不表達(dá)。

3、百邁客Hi-C研究?jī)?yōu)勢(shì)

百邁客自2016年初以來，利用Hi-C技術(shù)進(jìn)行染色體水平的基因組組裝及染色體三維構(gòu)象的研究，成功開發(fā)出六堿基、四堿基酶切方案，組裝、互作輕松拿下。在植物Hi-C領(lǐng)域，更是邁進(jìn)了一大步，在同行還只能處理植物活體樣本的時(shí)候，我們已經(jīng)可以輕松“駕馭”離體枝條，感覺一大波離體枝條在向小編招手~

迄今為止，保持著近100%的建庫(kù)成功率，積累了大量植物、動(dòng)物（哺乳動(dòng)物、昆蟲、水生動(dòng)物等）、微生物等的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)。植物一次建庫(kù)成功率在97%以上，很多物種對(duì)應(yīng)文庫(kù)的Valid Interaction Pairs(%)值在80%以上，最高達(dá)92.61%；動(dòng)物樣品文庫(kù)的Valid Interaction Pairs(%)平均值在60%，最高達(dá)86.68%；真菌樣品文庫(kù)的Valid Interaction Pairs(%)平均值在72%，最高達(dá)84.6%。2018，百邁客Hi-C服務(wù)平臺(tái)將繼續(xù)為您的科學(xué)研究保駕護(hù)航！如果您Hi-C測(cè)序技術(shù)感興趣，歡迎點(diǎn)擊下方按鈕聯(lián)系我們，我們將免費(fèi)為您設(shè)計(jì)文章思路方案。