轉(zhuǎn)錄組和代謝組解析馬鈴薯色素合成的分子機(jī)制

上期小編和大家分享了百邁客成功案例-轉(zhuǎn)錄組和代謝組解析風(fēng)信花色變化分子機(jī)制，大家可以發(fā)現(xiàn)，其中，代謝組并沒有走普通轉(zhuǎn)錄組項目的套路（基于測序結(jié)果，采用生物信息的手段，挖掘決定表型關(guān)鍵基因），而是采用靶向檢測幾種代謝物的方法，從代謝組角度進(jìn)一步驗證兩種花色風(fēng)信子花青素合成通路相關(guān)的基因。那么，隨著代謝組的不斷發(fā)展，目前經(jīng)典代謝組分析方法，更多的是傾向于基于代謝物檢測結(jié)果，通過生物信息分析的手段，深入挖掘與表型相關(guān)的關(guān)鍵代謝物，進(jìn)而輔助轉(zhuǎn)錄組挖掘決定表型的關(guān)鍵基因。今天，我們通過一篇經(jīng)典案例，來一探轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析的套路。

英文題目：Network analysis of the metabolome and transcriptome reveals novel regulation of potato pigmentation
中文題目：轉(zhuǎn)錄組和代謝組解析馬鈴薯色素調(diào)控分子機(jī)制
發(fā)表雜志：Journal of Experimental Botany
影響因子：5.830

研究背景

目前在許多水果、蔬菜和鮮花中，已鑒定花青素種類超過635種。果實的紫色和深紅色主要來源飛燕草色素，牽牛花色素和錦葵花色素；而亮紅色主要源自矢車菊素和天竺葵素。據(jù)報道，已鑒定出部分編碼花青素合成和調(diào)控的基因，但對于每種花青素生物合成途徑的調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。
彩色馬鈴薯因其富含較強(qiáng)抗氧化性的花青素而引起各國學(xué)者的廣泛關(guān)注。本研究利用轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析的方法，探索3種不同色澤馬鈴薯品種花青苷合成通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為馬鈴薯花青素的生物合成和調(diào)控相關(guān)的分子機(jī)制提供了新的見解。

材料與方法

樣品準(zhǔn)備：Hongyoung（淡紅色）、Jayoung（深紫色）、Atlantic（白色），在室溫散光照射下，誘導(dǎo)馬鈴薯發(fā)芽，收集嫩芽，每個品種6個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)由三個單株混合而成，共18個樣本。
1.轉(zhuǎn)錄組測序：Illumina Hiseq2000。
2.代謝組檢測：超高液相和質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-Q-TOF-MS）。
3.qRT-PCR：驗證花青素生物合成和馬鈴薯色澤相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，每個品種3個生物學(xué)重復(fù)。

技術(shù)路線

研究結(jié)果

01.不同色澤馬鈴薯差異代謝物分析
對三種不同色澤馬鈴薯樣本進(jìn)行主成分分析，結(jié)果顯示不同品種馬鈴薯代謝物差異顯著。代謝組檢測表明，在正離子模式下，共檢測出841個信號離子，其中Hongyoung和Atlantic共有559個信號離子，Jayoung 和Atlantic 共有441個信號離子，Jayoung 和Hongyoung 共有 454 個信號離子；在負(fù)離子模式下，共檢測出895個信號離子，其中Hongyoung 和 Atlantic共有 651 個信號離子，Jayoung 和Atlantic 共有470個信號離子，Jayoung和Hongyoung共有 466 個信號離子。

在正和負(fù)模式下的正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）的分?jǐn)?shù)圖和散點圖

圖2不同顏色馬鈴薯PCA分析和特征代謝物數(shù)目

02.Jayoung 與 Hongyoung 花青素衍生物差異分析
花青素是苯丙素通路中類黃酮合成的花色素苷的酰基糖苷。據(jù)報道，花青素衍生物飛燕草色素（Dp），芍藥色素（Pn）和錦葵色素（Mv）是紫色和深色的色素來源，而花青色素（Cy）和花葵素（Pg）的衍生物是亮紅色果實中的主要色素。結(jié)果顯示，Hongyoung與Jayoung在苯丙素合成途徑下游的黃酮類組分差異顯著，表明這些代謝物可能是造成馬鈴薯品種間色澤差異的關(guān)鍵因素。Hongyoung中芹黃素、山柰酚、二氫山柰酚和天竺葵色素衍生物的含量較高，而Jayoung中芍藥花青素、牽牛花色素、飛燕草色素和錦葵色素衍生物積累較多。

圖3 黃酮類化合物的二級質(zhì)譜分析

圖4 基于KEGG通路和文獻(xiàn)構(gòu)建的花青素合成通路示意圖

03.Atlantic, Hongyoung 和 Jayoung 差異基因分析
Hongyoung 、 Jayoung和Hongyoung 和 Jayoung共1044個差異基因；Hongyoung 和 Atlantic 中有 756 個差異基因，其中482 個基因上調(diào)，274 個基因下調(diào)。Jayoung 和 Atlantic 中有519 個差異基因，其中有248個上調(diào)基因，273個下調(diào)基因。根據(jù)其注釋功能將其分為20組（主要BIN），分為未知注釋轉(zhuǎn)錄本（37.7％），蛋白質(zhì)活性調(diào)控（10.3％），應(yīng)激（9.6％） ，其他代謝（7.3％），轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（5.7％），次級代謝（5.3％）和信號傳導(dǎo)（4.0％）。

圖5 不同馬鈴薯差異基因韋恩圖

表1 不同馬鈴薯差異基因注釋分析

04.轉(zhuǎn)錄組和花青素衍生物的關(guān)聯(lián)分析
對 22 個花青素衍生物和 167 個基因（三個馬鈴薯品種中類黃酮代謝、植物激素、信號通路、轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的差異表達(dá)基因）相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)有 119 個基因與這 22 個花青素衍生物相關(guān)性極高（相關(guān)系數(shù)>0.9）。在 Hongyoung 和 Jayoung 中對相關(guān)性高的 119 個基因和22個代謝物做共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，把119個基因參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)聚為5組（ClusterI-V），22 個花青素衍生物參與的代謝通路分為 4 組 (Group A-D) 。
Hongyoung中 Group A 代謝物的含量高于Jayoung，與 Cluster I 和 Cluster II 中的基因有較高的關(guān)聯(lián)性。而在 Jayoung 中 Group D 代謝物的含量較高，與 Cluster IV 和 Cluster V 中的基因有較高的關(guān)聯(lián)性。

圖6 基因與花青素相關(guān)代謝產(chǎn)物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

表2與花青素相關(guān)代謝物相關(guān)的調(diào)控基因的分類

05.差異表達(dá)基因RT-PCR驗證
隨機(jī)挑選 14 個基因進(jìn)行 RT-RCR 驗證，結(jié)果表明 Cluster I和Cluster II 中的基因（JAZ8, JAZ10, WRKY75, ERF1 和 MYB9）在 Hongyoung 的表達(dá)量較高；ClusterIV中的基因（MYB3和UFGT）在Jayoung中表達(dá)水平較高；而 Cluster III 中的基因在 Hongyoung 和 Jayoung 中的表達(dá)水平無明顯差異。RNA-seq和RT-PCR相關(guān)性系數(shù)0.89，進(jìn)一步證明測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖7花青素生物合成相關(guān)和馬鈴薯色澤潛在轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子RT-PCR驗證

文章亮點

1.本研究對三個不同品種的馬鈴薯樣品同時做轉(zhuǎn)錄組和代謝組，首先通過代謝組分析不同馬鈴薯品種與色澤合成的差異代謝物，然后采用轉(zhuǎn)錄組，篩選與色澤合成相關(guān)的類黃酮代謝、植物激素、信號通路、轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的差異基因，最后將色澤合成相關(guān)的差異代謝物和差異基因做關(guān)聯(lián)分析，挖掘馬鈴薯色澤的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
2. 本研究基于轉(zhuǎn)錄組測序和代謝組檢測結(jié)果，主要通過生物信息分析手段，更高效的挖掘與表型相關(guān)的差異基因和代謝物，同時將基因和代謝物變化以精美的圖形呈現(xiàn)，為高分文章的發(fā)表添磚加瓦。

文章框架思路如下

看了文章框架是不是感覺hin簡單啊，轉(zhuǎn)錄組標(biāo)準(zhǔn)分析→代謝組標(biāo)準(zhǔn)分析→轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析→RT-PCT驗證，即可輕松實現(xiàn)文章發(fā)表，哈哈，這就是轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析套路啦，大家趕快試一下吧，超出你的預(yù)期哦！

畫 外 音~~~

參考文獻(xiàn)
Kyoungwon Cho ., Kwang-Soo Cho ., Hwang-Bae Sohn .,et al. Network analysis of the metabolome and transcriptome reveals novel regulation of potato pigmentation. Journal of Experimental Botany. 2016, 67(5), 1519–1533 doi:10.1093/jxb/erv549 .

轉(zhuǎn)錄調(diào)控事業(yè)部 蘇靜靜 | 文案
吳戈宇 | 審核
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