雜志期刊：Scientific Reports
發(fā)表時間：2017年9月12日（online）
1.研究背景
植物類病變(lesion mimic, LM)又稱類病斑，是指在沒有受到任何病原菌侵染的條件下，植物自發(fā)產(chǎn)生壞死斑點。這種局部細胞的壞死屬于細胞程序化死亡（PCD），細胞程序化死亡在植物生長發(fā)育過程中廣泛存在，特別是受到生物或非生物脅迫，當受到不相容的病原菌感染時，植物可以在受感染的部位啟動某種形式的PCD，以限制病原體的傳播，這是一種先天性的免疫反應(yīng)，稱為超敏反應(yīng)（HR）。HR是植物細胞為限制病原菌生長而快速死亡的一種方式，其誘導(dǎo)的細胞死亡可以激發(fā)鄰近組織的防衛(wèi)反應(yīng)(defense response)和植株的系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)。
水稻與玉米類病變突變體表型
研究HR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)最有效的方式就是利用一類表現(xiàn)型與病原菌侵染后HR癥狀類似的突變體開展工作，這些突變體稱為類病變突變體（lesion mimic mutation，LMM）。植物類病斑突變體根據(jù)其表型特征及PCD發(fā)生是否可控，分為起始型突變體和擴散型突變體。前者是指在無病原菌侵染下，植物體自發(fā)形成一些位置和大小相對穩(wěn)定的斑點；后者是指斑點形成后易擴散，且這種類型的斑點之間沒有明顯的界限。研究發(fā)現(xiàn)，類病變發(fā)生的機制相當復(fù)雜，主要受抗病、調(diào)控死亡及代謝相關(guān)基因的調(diào)控。其次，活性氧途徑、水楊酸、茉莉酸、乙烯以及一氧化氮在植物抗病和超敏反應(yīng)中也發(fā)揮了重要作用。
2.實驗材料
轉(zhuǎn)錄組材料為lmd、oe21、NT，lmd突變體是從BpGH3.5轉(zhuǎn)基因株系中分離出；oe21株系是正常的BpGH3.5轉(zhuǎn)基因株系；對照材料是非轉(zhuǎn)基因的NT。
測序平臺：百邁客Illumina HiSeq 2500，PE125
3.結(jié)果解讀
1、lmd突變體表型鑒定
作者在研究BpGH3.5在樺樹中的功能時偶然獲得了lmd突變體。構(gòu)建的21株OE-GH3.5株系中，唯獨lmd葉片表現(xiàn)出壞死斑點并伴有早衰的現(xiàn)象。這很明顯是一種病變的表現(xiàn)，當這種情況出現(xiàn)，很顯然我們要思考兩個問題：
一、lmd獨特的表型顯然不是過量表達BpGH3.5導(dǎo)致的，那么引起lmd與其他20株BpGH3.5超表達株系表型差異的原因是什么？
二、是否是感染某種病原菌導(dǎo)致的lmd出現(xiàn)壞死斑點的表型。這兩個問題的連接點就在于表型，但解決的方式不一樣。
一問題解決的是lmd內(nèi)部矛盾；二問題探討的是外部因素。解決好這兩個問題，也就揭開了lmd身上的神秘面紗。在解決這個問題之前，首先要明確lmd展現(xiàn)出的phenotype外部因素是什么？植物表現(xiàn)出壞死斑點，最容易聯(lián)想到病菌，但在木本植物培養(yǎng)基上的lmd幼苗同樣表現(xiàn)出了這種表型，這說明引起lmd表型的原因并不是病原菌而是一種自發(fā)的現(xiàn)象，作者做出判斷l(xiāng)md應(yīng)該是一種lesion mimic mutants（LMM，類病變突變體）。而關(guān)于lmd的內(nèi)部矛盾也很好理解，超表達株系中某一株系表現(xiàn)出與眾不同的表型，很容易讓人想到是否是插入位點影響了某個重要功能基因。作者接下來就通過一系列實驗來求證這些觀點。
圖1：Lmd生長相對遲緩
圖2：lmd葉片
圖3：立體顯微鏡下不同葉齡的葉片病變部位
類病變突變體通常會表現(xiàn)出自發(fā)性的細胞程序性死亡（PCD），作者通過伊文思藍染色比較了lmd與NT、oe21的細胞死亡情況（圖4）；丙二醛含量檢測間接反映了lmd細胞損壞程度也更高（圖5）；
圖4：lmd葉片染色以及與NT、oe21的對比分析
圖5：MDA含量測定
2、細胞結(jié)構(gòu)變化揭示lmd突變體表型
細胞程序性死亡經(jīng)常伴隨著細胞結(jié)構(gòu)的變化，光學顯微鏡顯示lmd突變體的死細胞聚集在一起，而周圍的細胞是正常結(jié)構(gòu)的，死細胞并沒有明顯擴散痕跡（圖6），表明lmd是起始型的類病變突變體。接下來作者用透射電鏡觀察了lmd葉片細胞的超微結(jié)構(gòu)。與oe21和NT相比，在lmd突變體中觀察到更多的死細胞，一些細胞產(chǎn)生吞噬作用，細胞器消失，只留下一個空細胞壁（圖7），這一結(jié)果表明了lmd突變體中發(fā)生了典型的細胞程序性死亡。樺樹葉片上有許多葉腺，在葉片成熟后會退化。由于lmd表現(xiàn)出葉片早衰現(xiàn)象，作者用掃描電鏡掃描葉片表面，以觀察lmd是否有變化。在第三個葉片上，發(fā)現(xiàn)lmd葉片上的葉腺體比NT和oe21葉片少（圖8）。SEM觀察表明，lmd確實發(fā)生了早衰。
圖6:切片顯示病變部位發(fā)生細胞死亡
圖7：投射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)
圖8：葉腺體結(jié)構(gòu)觀察
3、轉(zhuǎn)錄組揭示lmd體內(nèi)的分子水平變化
為了深入了解lmd體內(nèi)的分子水平變化，作者進行了轉(zhuǎn)錄組測序。對差異基因進行分析發(fā)現(xiàn)了許多與致病相關(guān)的基因，如WRKY、谷胱甘肽-轉(zhuǎn)移酶(GST)、乙烯反應(yīng)因子(ERF)和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine-protein kinase)，這些都已經(jīng)被研究證實與防御反應(yīng)相關(guān)。GO富集分析顯示，參與催化活性、抗氧化活性、免疫系統(tǒng)過程和刺激響應(yīng)的差異基因發(fā)生了顯著富集（圖9）。
圖9：GO富集分析結(jié)果
4、lmd體內(nèi)過氧化物積累
許多LMM壞死病變的形成都與ROS相關(guān)。為了確定lmd的程序性細胞死亡是否伴隨著活性氧的產(chǎn)生，作者進行了DAB染色和DCFH-DA染色，結(jié)果顯示lmd體內(nèi)積累了較多的過氧化物（圖10）。
圖10：DAB染色與DCFH-DA染色結(jié)果
5、lmd突變體對Alternaria alternata（煙草赤星病菌）具有較強抗性
研究發(fā)現(xiàn)類病變突變體增強了對病原菌的抗性，為了測試lmd突變體是否對Alternaria alternata有抗性，作者將孢子懸浮液噴灑在NT、oe21和lmd幼苗上。7天之后，NT和oe21感染嚴重，出現(xiàn)了幾片枯萎葉片，而在lmd突變體中觀察到的枯萎葉片很少，盡管其葉片上有許多病變（圖11）。噴施17天后，NT和oe21的發(fā)病率均在90%以上，但lmd仍未出現(xiàn)感染葉片。lmd的發(fā)病時間出現(xiàn)在噴灑后22天，而此時，lmd的發(fā)病率為45.55%，但NT和oe21的發(fā)病率均為100%（圖12）。
圖11：感染Alternaria alternata后NT、oe21、lmd的表型
圖12：發(fā)病率統(tǒng)計結(jié)果
6、揭開lmd的廬山真面目
前面提到過，作者構(gòu)建了21個BpGH3.5超表達株系，由于其他20個BpGH3.5株系沒有顯示與lmd相似的表型，因此lmd的表型不是BpGH3.5過表達的結(jié)果，而是與T-DNA插入有關(guān)。作者通過基因組重測序與TAIL-PCR證實lmd基因組上有兩個T-DNA插入位點，其中一個插入位點位于BpEIL1啟動子區(qū)域，導(dǎo)致BpEIL1表達水平顯著下降，這可能是導(dǎo)致lmd出現(xiàn)類病變表型的主要原因。
創(chuàng)新點
類病變突變體在水稻、玉米、擬南芥等植物中研究較多，但在木本植物中卻鮮有報道，本研究通過轉(zhuǎn)錄組手段研究了樺樹lmd突變體產(chǎn)生類病變表型的分子機制，為進一步研究木本植物類病變基因提供了基礎(chǔ)。
讀后感
故事到這就結(jié)束了，讀完這篇文章后，小編最大的感想就是“無心插柳柳成蔭”，偶然獲得的超表達株系表現(xiàn)出獨特的表型，并借用轉(zhuǎn)錄組與生理實驗的手段，作者解開了圍繞在lmd身上的神秘面紗。突然想起了一句話，千萬別擔心生物學沒有科研方向，隨便一個坑就能給你一條路！年關(guān)將至，各位奮斗在科研路上的大咖們，您的年終匯報準備的咋樣了？
參考文獻
Li R, Chen S, Liu G, Han R, Jiang J. Characterization and Identification of a woody lesion mimic mutant lmd, showing defence response and resistance to Alternaria alternate in birch. Sci Rep. 2017 Sep 12;7(1)
楊瑞丨文案
吳戈宇 | 審核
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