基因組Survey測(cè)序分析

1 項(xiàng)目概況

1.1合同分析內(nèi)容

(1) 測(cè)序得到不低于50倍覆蓋度的數(shù)據(jù)量。

(2) 樣本質(zhì)量評(píng)估：

????a)外源物種污染率評(píng)估；

????b)線粒體含量評(píng)估；

(3) 基因組評(píng)估：

????a) 基因組大小評(píng)估；

????b) 雜合率評(píng)估；

????c) 重復(fù)序列比例評(píng)估；

????d) GC含量評(píng)估。

1.2 分析結(jié)果概述

(1) 測(cè)序獲得xx ?Gb數(shù)據(jù)，總測(cè)序深度約為xx ×，Q20比例達(dá)到xx %以上，Q30比例達(dá)到xx %以上。

(2) 通過(guò)與NT庫(kù)比對(duì)表明樣品不存在污染。

(3) 對(duì)物種的線粒體評(píng)估，發(fā)現(xiàn)線粒體含量很低。

(4) 估計(jì)基因組的大小約xx Mb，雜合率約xx %，重復(fù)序列含量約xx %。

(5) 估計(jì)基因組的GC含量約xx %。

1.3 項(xiàng)目分析總結(jié)

????????分析表明，樣品不存在外源物種污染，且質(zhì)體含量低，能用于構(gòu)建精細(xì)圖；同時(shí)，估計(jì)基因組大小約xx? Mb，基因組的雜合率約xx %，重復(fù)序列含量約xx %，因此該物種基因組屬于高雜合的復(fù)雜基因組。推薦的測(cè)序方案為xx? ×的270 bp文庫(kù)數(shù)據(jù)和xx? ×的20 Kb三代測(cè)序文庫(kù)數(shù)據(jù)。見(jiàn)表1。

2 項(xiàng)目流程

2.1 實(shí)驗(yàn)流程

????????實(shí)驗(yàn)流程按照Illumina公司提供的標(biāo)準(zhǔn)protocol執(zhí)行，包括：DNA文庫(kù)制備實(shí)驗(yàn)和測(cè)序?qū)嶒?yàn)。實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖1

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖

????????提取基因組DNA ,進(jìn)行小片段文庫(kù)建庫(kù)測(cè)序。分為以下四個(gè)步驟：

（1）文庫(kù)構(gòu)建：物理破碎法（超聲波震蕩）將合格的基因組DNA破碎至目的片段（270 bp），然后經(jīng)過(guò)末端修復(fù)、加A、加接頭、目標(biāo)片段選擇和PCR等步驟構(gòu)建小片段測(cè)序文庫(kù)文庫(kù)；

（2）文庫(kù)質(zhì)檢：利用2100和Q-PCR檢測(cè)文庫(kù)片段大小和文庫(kù)定量，確定文庫(kù)是否符合測(cè)序標(biāo)準(zhǔn) ;

（3）芯片固定：通過(guò)橋式PCR將文庫(kù)固定到測(cè)序芯片上；

（4）上機(jī)測(cè)序利用Hiseq測(cè)序儀對(duì)文庫(kù)進(jìn)行雙端150 bp（PE 150）測(cè)序，測(cè)序所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)控后用于下一步信息分析。

2.2 信息分析流程

雙端測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)評(píng)估雙端測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)評(píng)估（GC分布統(tǒng)計(jì)、質(zhì)量值Q20、Q30評(píng)估）、過(guò)濾后得到高質(zhì)量的數(shù)據(jù)(clean reads)，用于基因組大小的評(píng)估、基因組的組裝、GC含量的統(tǒng)計(jì)、雜合率的統(tǒng)計(jì)(以及組裝后的評(píng)估)。具體信息分析流程見(jiàn)圖2。

圖2 基因組調(diào)研圖信息分析流程

3 分析結(jié)果

3.1 測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)

????????使用醫(yī)蛭樣品的基因組DNA構(gòu)建270 bp文庫(kù)，在 Illumina Hiseq測(cè)序平臺(tái)測(cè)序并過(guò)濾得到12.43 Gb高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，總測(cè)序深度約為76 ×，測(cè)序數(shù)據(jù)Q20比例均在95.34%以上，Q30比例均在89.23%以上，滿足合同要求的50 ×以上的測(cè)序數(shù)據(jù)量。文庫(kù)高質(zhì)量的數(shù)據(jù)量的統(tǒng)計(jì)信息見(jiàn)表2。

表2 ??樣品測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

3.2 樣本質(zhì)量評(píng)估

3.2.1 樣品污染評(píng)估

????????樣品如果存在污染不僅會(huì)降低有效數(shù)據(jù)量，同時(shí)還會(huì)影響調(diào)研圖分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，導(dǎo)致基因組大小、雜合率、重復(fù)序列比例和GC含量等基因組特征評(píng)估結(jié)果出現(xiàn)較大偏差，使得基因組組裝建庫(kù)策略出現(xiàn)偏差，最終影響后續(xù)的基因組組裝效果。為了判斷提取的樣品DNA是否受到污染，我們從測(cè)序得到的270 bp文庫(kù)中，隨機(jī)取10,000條單端reads，與NT庫(kù)進(jìn)行BLAST^[1]比對(duì)，270 bp文庫(kù)能夠比對(duì)上NT庫(kù)的reads分別占總reads數(shù)的1.71%，其中比對(duì)到xx 和xx上的reads數(shù)分別占比對(duì)上NT庫(kù)reads數(shù)的34.5%和6.43%，這兩個(gè)物種皆為醫(yī)蛭的近緣物種，且比對(duì)結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)植物等異常比對(duì)，因此該樣品測(cè)序數(shù)據(jù)不存在污染，可用于基因組調(diào)研圖分析。一般的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)：如果有一定比例的reads比對(duì)上進(jìn)化距離較遠(yuǎn)的物種如植物，微生物等，則判斷樣品可能存在污染，需要進(jìn)一步檢查原因。具體比對(duì)統(tǒng)計(jì)表見(jiàn)表3。

表3 ??270 bp文庫(kù)NT庫(kù)比對(duì)詳表

3.2.2 線粒體含量評(píng)估

????????由于線粒體中存在核酸序列，如果物種測(cè)序文庫(kù)中線粒體DNA含量過(guò)高時(shí)，會(huì)影響后期基因組組裝。因此評(píng)估文庫(kù)中線粒體DNA含量對(duì)判斷數(shù)據(jù)能否用于后續(xù)基因組組裝非常必要。為了評(píng)估測(cè)序數(shù)據(jù)中線粒體的含量，我們利用Illumina Hiseq測(cè)序得到的270 bp文庫(kù)與醫(yī)蛭近緣物種的線粒體序列（42,362 bp）進(jìn)行SOAP^[2]比對(duì)。比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙端比上的reads數(shù)為166，占總reads的0.00%，單端比上的reads數(shù)為13，占總reads的0.00%，這兩個(gè)的比例都低于經(jīng)驗(yàn)值5%。由此判斷270 bp文庫(kù)測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)體含量很低，不影響后期基因組的組裝。比對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4-1 ??270 bp文庫(kù)SOAP比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

3.3 基因組特征評(píng)估

????????利用基因組調(diào)研圖進(jìn)行基因組特征的評(píng)估，分為四個(gè)方面：

1) 評(píng)估基因組大小;

2) 評(píng)估重復(fù)序列比例；

3) 評(píng)估雜合情況；

4) GC含量情況。

3.3.1 基因組大小、重復(fù)序列比例和雜合率評(píng)估

????????利用270 bp文庫(kù)數(shù)據(jù)構(gòu)建k=19的kmer分布圖（見(jiàn)圖3），進(jìn)行基因組大小、重復(fù)序列比率和雜合率的評(píng)估。由圖3知，平均kmer深度即主峰對(duì)應(yīng)的kmer深度為62。kmer深度出現(xiàn)在主峰對(duì)應(yīng)深度2倍以上的序列為重復(fù)序列，即深度大于125的kmer序列為重復(fù)序列。kmer深度出現(xiàn)在主峰對(duì)應(yīng)深度一半處的序列為雜合序列，即深度出現(xiàn)在31附近的kmer序列為雜合序列。根據(jù)kmer深度信息，總kmer數(shù)目/平均kmer深度即為基因組大小，估計(jì)基因組大小約162.99 Mbp。依據(jù)kmer分布情況，估計(jì)重復(fù)序列含量約16.23%，評(píng)估出的雜合率約為1.79%，因此該物種基因組屬于高雜合的復(fù)雜基因組。

圖3 Kmer分布圖

3.3.2 評(píng)估GC含量

????????基因組GC含量對(duì)二代基因組測(cè)序的隨機(jī)性有較大影響。過(guò)高(>65%)或過(guò)低(<25%)的GC含量會(huì)導(dǎo)致測(cè)序偏向性，嚴(yán)重影響基因組分析結(jié)果。物種GC含量是評(píng)估調(diào)研圖分析準(zhǔn)確性和后續(xù)基因組組裝難度的重要指標(biāo)之一。通過(guò)對(duì)調(diào)研圖文庫(kù)測(cè)序數(shù)據(jù)分析，該物種基因組的GC含量約38.03%，較為適中，不會(huì)影響調(diào)研圖分析的準(zhǔn)確性。見(jiàn)表5。

表5 ??基因組GC含量評(píng)估

????????綜上所述，該基因組大小約為162.99 Mb，重復(fù)序列比例約16.23%，雜合率約1.79%，基因組的GC含量約38.03%，從基因組基本結(jié)構(gòu)特征上看，該物種基因組屬于高雜合的復(fù)雜基因組。