原核鏈特異性轉(zhuǎn)錄組

答：（1）核酸濃度或總量不足；（2）雜質(zhì)污染；（3）核酸降解。

答：

嚴(yán)重降解：無清晰主帶、條帶彌散、無法建庫。

中度降解：有清晰主帶、有適度拖尾，且有 5 kb 以下大小的拖尾片段。質(zhì)檢判定為 C 不合格，可適用于風(fēng)險建庫。

輕度降解：有清晰主帶、有輕度拖尾，且 5 kb 以下無拖尾片段?？山◣鞙y序。

答：對于病原微生物，建議老師送抽提好的 RNA 樣品，不建議接受病原微生物樣品。

答：RIN 值（RNA integrity number）通常代表著 RNA 質(zhì)量的高低，從 0~10，值越大就說明 RNA 的質(zhì)量越高，完整性越好。它是由 labchip GX 儀器檢測出來的。目前我們規(guī)定 RIN 值大于等于 4.5 的 RNA 樣品屬于合格樣品。

答：不一定，對于一些特殊的樣品，它們的標(biāo)準(zhǔn)峰圖與典型的原核 RNA 峰圖不一致。因此，樣品檢測 RIN 值即使不合格，但如果無明顯降解、連續(xù)兩批樣品出現(xiàn)一致的情況，可認(rèn)為是樣品的特殊性造成的，可用于建庫測序。

• 參考基因組選擇不合適，此時建議重新查找正確的基因組。若實在沒有合適的參考基因組，建議改為無參進行后續(xù)分析；
• 其他物種污染(如病菌)等，若是本物種病菌的污染，建議剔除該樣本；若是非本物種病菌的污染，建議聯(lián)系公司處理;
• 樣品本身的問題(樣本前期質(zhì)量不高、物種本身參考基因組不好、實驗處理為多個菌互作等)，此時若老師覺得跟自己的實驗需求一樣，則不需剔除樣本。若已經(jīng)嚴(yán)重影響了后續(xù)實驗，建議剔除質(zhì)量不高的樣本或者剔除病菌/病毒的序列。

• 轉(zhuǎn)錄組的重復(fù)性是否好，是跟樣品有著非常密切的關(guān)系。首先要明確自己的實驗設(shè)計，如臨床樣本等， 由于個體之間差異巨大，可能本身就存在極大差異，若個體本身差異就大，有差異也是正?，F(xiàn)象；
• 從取樣方面及RNA抽提質(zhì)檢方面考慮；
• 轉(zhuǎn)錄組測序通常要求設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)樣本，如果樣本足夠多，建議比預(yù)期實驗設(shè)計多送1~2個樣本測序，以便后續(xù)某個樣品與組內(nèi)其它樣本出現(xiàn)離群情況，直接剔除離群樣本，省時省力。若測序樣本較少，無法剔除樣本，也可以考慮對同一批次的備份樣本再次測序，后續(xù)再重新分析；
• 體現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組重復(fù)性好壞的有三個分析：PCA，距離熱圖以及表達量聚類熱圖。

• 根據(jù)樣本重復(fù)性好壞(PCA和相關(guān)性熱圖)，建議客戶剔除異常樣本、重新分組后進行分析。
• 若組內(nèi)樣本重復(fù)性較好，但可能由于處理之間差異性本身就不明顯，可以通過調(diào)整參數(shù)（標(biāo)準(zhǔn)為：FDR≤0.05且|log2FC|≥1），通過降低差異基因的標(biāo)準(zhǔn)提高差異基因的個數(shù)，比如調(diào)整FDR為P-value，適當(dāng)放寬差異倍數(shù)(將FC從2設(shè)置為1.5)，或者更換不同的分析軟件進行重新分析。