番茄一直被視為研究果肉發(fā)育的模式植物，然而，大多研究集中于果實成熟的調控。有一些基因被認為調控果實葉綠體發(fā)育，例如，GLK2是葉片與果實組織葉綠體發(fā)育的正調控因子，通過激活光合相關基因的表達來調控葉綠體發(fā)育；在野生型番茄中，SlGLK2及其他光合、葉綠體相關基因呈現(xiàn)梯度表達，在幼嫩果實中常呈現(xiàn)“綠肩”表型。另一個相關轉錄因子APRR2-LIKE在調控葉綠體發(fā)育中，與SlGLK2表現(xiàn)相似功能。其他一些正向或負向調控因子，如BEL-LIKE HOMEODOMAIN 11，SlARF10，DET1等。
辣椒在幼果果色及葉綠素含量方面存在豐富自然變異，控制這種變異的第一個基因是APRR2-LIKE，其功能缺失會降低葉綠素含量并出現(xiàn)白色幼果。Brand?et al., 2012利用遺傳群體定位到兩個控制葉綠素含量的主效QTL，pc8.1與pc10.1，研究發(fā)現(xiàn)CaGLK2與pc10.1共分離，并調控葉綠素含量，暗示CaGLK2是pc10.1的靶標基因，而對于pc8.1的靶標基因還不清楚。
今天給大家分享一篇由以色列與美國科學家合作完成的一項研究“The zinc-finger transcription factor CcLOL1?controls chloroplast development and immature pepper fruit color in Capsicum chinense?and its function is conserved in tomato”。該研究對QTL?pc8.1（即pc1）進行解析，利用BSA-Seq、BSR-Seq、交換單株篩選、DEGs分析、CRISPR等方法定位并證明辣椒鋅指轉錄因子CcLOL1是此QTL的靶標基因。研究發(fā)現(xiàn)，該基因以果實特異性方式控制葉綠體大小與葉綠素含量，并且在番茄果實中它的同源基因是保守的。
?圖1. 親本：C. annuum?1154與C. chinense?PI 152225（Brand et al., 2012）
材料與方法
1. 群體構建：1154（深綠；C. annuum），PI 152225（淡綠；C. chinense）；86-45（BC4F3 NIL，含來自PI152225的pc1區(qū)段）（圖 1.及圖 2.）
圖2. 群體構建流程圖
2. BSA-Seq：F2群體（1154 × NIL 86-45）混池——30個（淡綠果色的葉片）+30個（深綠果色的葉片），每個混池測序深度20×，PE150，Illumina HiSeq 4000；參考基因組—— CM334 v. 1.55 (Kim et al., 2014)
3. BSR-Seq：1154與PI 152225以及2個F2群體（1154 × NIL 86-45）極端混池——每個親本或混池各取15個單株，每個單株取3個幼果，設3個生物學重復；SE60，Illumina HiSeq 2500；參考基因組—— CM334 v. 1.6 (Kim et al., 2017)
4. QTL-NILs差異表達分析： NIL-1973, NIL-1975, NIL-1976與親本 (1154與PI 152225)；取樣時間為授粉后10天與30天， 3個生物學重復；Illumina HiSeq 4000 single-read sequencing technology
5. 色素含量、白利度及成熟果實重量考察
6. 葉綠體結構觀察：Leica SP8激光共聚焦顯微鏡 (Leica, Wetzlar, Germany)；檢測葉綠體面積與單位面積葉綠體數(shù)目
7. CRISPR/Cas9：敲除番茄基因Solyc08g077060 (tomato ortholog of CcLOL1)，獲得基因敲除株系lol1CR-25、lol1CR-43、lol1CR-57與lol1CR-58
8. 品種：C. annuum accessions——1154；C. annuum var glabriusculum accessions——Cora, Nayoi and 1202；C. chinense accessions——CA4, USDA 162, 170, 174-3, 164-3, 180-2, PI 159236, 187-2, 4, 165-2
結果與分析
BSA-Seq分析（pc1區(qū)域）
為確定pc1在基因組中的具體位置，本研究利用F2群體（1154 × NIL 86-45）極端混池進行BSA-Seq分析，通過與參考基因組CM334 v. 1.55比對，混池間共檢測出14805個SNPs，其中，有8235個SNPs分布在Chr.1上； 另外還有5670個SNPs位于4條未被組裝的scaffolds上（scaffold1362， scaffold1381，scaffold1659與scaffold799），有趣的是，這些scaffolds上的番茄同源基因與辣椒Chr.1存在共線性。SNPs在Chr.1上分布特點是從0M-16M SNP數(shù)目逐漸增加，到17M后SNP數(shù)目突降，暗示滲入的QTL等位區(qū)段終止于這個位置。以上結果表明，pc1定位在Chr.1的SNP峰值區(qū)或者富含SNPs的未被組裝的scaffolds上（圖3.a）。
圖3. 混池間SNPs分布（a. BSA-seq與b. BSR-seq）及pc1區(qū)域物理圖譜（c.）
重組分析（pc1區(qū)域）
為進一步精細定位pc1，本研究對624個F2（1154 × NIL 86-45）單株標記分型以篩選QTL區(qū)域內的交換單株。基于前期研究，標記T1341與QTL peak連鎖最為緊密 (Brand et al., 2012)，作者又在T1341附近開發(fā)出6個標記，在標記F23與H05間，共篩選出34個F4交換單株，可代表6種基因型組合，橫跨Chr.1：5cM的區(qū)間。為排除pc1與pc10互作的影響，作者將所有交換單株的CaGLK2固定為1154等位基因。結果分析暗示，F(xiàn)23與LOL1是與QTL連鎖最為緊密的標記，因為line 15含PI 152225最短的導入片段且葉綠素含量顯著低于1154，而line 260在這2個標記間含1154等位且與1154葉綠素含量沒有顯著性差異。此外，lines 53與260在APRR2-like位點含有PI 152225等位，葉綠素含量卻與1154沒有顯著差異，暗示此基因（APRR2）在本研究中的遺傳背景下不影響葉綠素含量（表1.）。
CM334 v. 1.6 （Kim et al., 2017）已將上述4個scaffolds（scaffold1362，scaffold1381，scaffold1659與scaffold799）整合進Chr.1中，通過pc1區(qū)域的標記比對，F(xiàn)23到H05區(qū)間大小為2Mbp。
表1. pc1區(qū)域標記基因型與辣椒幼果葉綠素含量（雙親與6個重組系）
pc1?以果實特異性方式調控葉綠體區(qū)室大小與葉綠素含量
為確定pc1對果實發(fā)育的影響，本研究對line 1154（深綠NIL）與15（淡綠NIL）的葉綠體參數(shù)進行考察。葉綠素含量測定結果顯示，1154與15在綠色辣椒幼果中存在顯著差異（圖 4.a，b），而在葉片中沒有顯著差異（圖 4.c）；激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與1154相比，line 15綠色幼果的葉綠體較小且具有較少的葉綠體數(shù)目（圖 4.d，e）。這些結果暗示pc1通過調控葉綠素含量以及葉綠體大小來影響辣椒幼果顏色。
為考察幼果期葉綠體發(fā)育差異是否會影響成熟期果實特征，作者又比較了1154與15的幾個成熟果實特征。結果顯示，果實重量與白利度在兩者間并無不同（圖 4.f，g），然而，1154比15擁有更高的類胡蘿卜素素總量（圖 4.h）。
圖?4. QTL- NILs（pc1）葉綠素含量、葉綠體大小以及成熟果實特征.
BSR-Seq分析（pc1區(qū)域）
為識別QTL區(qū)候選基因，解析其分子及細胞學機制，本研究對雙親（1154與PI 152225）及兩個極端混池（1154 × NIL 86-45）進行轉錄組分析。BSR-Seq得到21.2，21，21.9與21.2 M個reads（1154，dark-green bulk，light-green bulk與PI 152225），共分析得到4114個純合SNPs，其中2264個SNPs定位在Chr.1。SNPs分布峰值區(qū)間位于Chr.1：8 Mbp區(qū)間（即，13-21 Mbp；CM334 v.1.6），峰值中心落在18 Mbp（圖3b，c），而在21.6 Mbp的位置SNPs數(shù)目突降。BSA-Seq （圖 3a）與BSR-Seq （圖 3b）比較發(fā)現(xiàn)，QTL峰值位點與SNP突降位置出現(xiàn)一個遷移，這是因為所用參考基因組不同所致，前者是CM334 v. 1.55（Kim et al., 2014），后者為CM334 v. 1.6 （Kim et al., 2017）。
差異表達候選基因分析（pc1）
與淡綠色親本與混池對照相比，在1154與深綠色混池間共有240個基因發(fā)生上調表達，284個基因下調表達。
綜合考慮重組交換（表1.），BSA-Seq與BSR-Seq（圖3.）分析，本研究將QTL區(qū)間錨定在2.2 Mbp（19.4-21.6 Mbp），此區(qū)間共包含51個基因，其中，有11個基因在混池間發(fā)生差異性表達。深綠色混池中3個上調表達基因可能與葉綠體發(fā)育相關，因而被視為候選基因進行下一步分析。經(jīng)過分析，第一個基因CA00g61750與第二個基因CA00g77840或與葉綠素含量不相關或表達量無顯著差異，因而被排除；第三個基因CA00g77830，鋅指轉錄因子LOL1，是擬南芥脅迫誘導細胞死亡的正調控因子，并且它的水稻同源基因過表達可提高葉綠素b含量，此外，CA00g77830在綠色組織高度表達，而在成熟果實中表達減少，暗示此基因在調控葉綠素含量方面發(fā)揮重要功能。
第四個差異表達基因CA00g77800，編碼MIP1蛋白，在深綠色混池及親本中呈下調表達。MIP1是否調控葉綠素含量并不清楚，但是擬南芥數(shù)據(jù)庫STRING蛋白互作網(wǎng)絡預測顯示LOL1與MIP1存在互作。此外，MIP1在葉片與莖中表達量很低，在果實中表達量相對較高，并在成熟果實中達到最高，然而，在成熟期表達水平不變。
pc1?參與調控辣椒幼果的光合與氧化還原過程
為研究pc1參與影響的細胞學過程，本研究對混池間983個差異表達基因進行GO富集分析并根據(jù)生物過程進行分類（圖5）。最顯著的GO term過程與光合作用及氧化還原有關，這兩個過程包含184個DEGs，被分成17個亞類，其中最大的一類是氧化還原過程。這一類基因與葉綠素合成下調有關，例如，POR，CAO與HEMA1，還與葉綠素降解基因上調有關，例如，CA00g73130，暗示葉綠素合成與降解受這個QTL調控。另一類重要基因，包含Chlorophyll a/b-結合蛋白的多個成員基因（CA01g17090，CA02g12050，CA02g12060，CA02g12070等），在淡綠混池中下調表達，它們參與光合、蛋白發(fā)色團及光刺激響應等過程。另外，若干與碳固定有關的Rbc家族基因在淡綠混池中也呈現(xiàn)下調表達。
多個DEGs的上調或下調表達與氧化脅迫或細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)相關，例如，CA03g06870 (Superoxide dismutase)，CA10g19020 (Thioredoxin)，CA00g63370 (Dihydrolipoyl dehydrogenase)等。此外，其它重要過程包括碳水化合物代謝、脂質代謝、次級代謝、類黃酮合成以及DNA復制。
圖?5. 混池間差異表達基因的GO生物過程分類（FDR ≤ 0.05）.
CcLOL1與CcMIP1在C. chinense?PI 152225中發(fā)生移碼突變
對1154與PI 152225中的CcLOL1 ORF測序分析發(fā)現(xiàn)，在PI 152225中26bp處存在單堿基C的插入，引起移碼突變，在第19個氨基酸處造成提前終止，在line 15中包含同樣的突變；而在C. annuum與C. annuum?var glabriusculum中雖然葉綠素含量變異顯著，但是它們的CcLOL1?ORF序列均與1154相同。因此，作者又進一步分析了CcLOL1在12個品種中表達情況與葉綠素關系，然而，兩者之間的相關系數(shù)并不顯著。
對1154與PI 152225中的CcMIP1 ORF測序分析發(fā)現(xiàn)，在PI 152225中570 bp處存在32 bp的插入，引起移碼突變，在第209個氨基酸處造成提前終止。除了C.annuum?var glabriusculum?lines Nayoi與1202在相同位置有32 bp插入之外，其它品種CcMIP1序列均與1154一致。
C. chinense幼果果色變異遺傳位點等位多樣性分析
由于在PI 152225中CcLOL1與CcMIP1及CaGLK2都是突變等位，因此作者又對另外10個C. chinense品種測序分析這3個基因以及CcAPRR2以求獲得等位多樣性并分析出它們與葉綠素含量的關系。結果暗示極端淡綠果色的3個基因（CcLOL1、CcAPRR2、CaGLK2）均是突變等位，而C. annuum 1154在這些位點都是野生型等位基因。對于葉綠素含量中等的一些品種，3個基因其中有1個為突變等位：CcLOL1?（164-3，180-2，PI 159236與CA4），CaGLK2（lines 187-4與USDA 162）與CcAPRR2（line 187-2）。深綠果色品種165-2突變CcAPRR2后，會引起葉綠素含量降低；而被誘變后幼果葉綠素含量變化并不一致，暗示CcMIP1其獨立于CcLOL1。
CRISPR/Cas9敲除番茄基因SlLOL1?導致幼果呈淡綠色
為證明CcLOL1參與調控葉綠體發(fā)育與葉綠素含量，本研究利用CRISPR/Cas9技術敲除番茄栽培種MP1中的辣椒同源基因Solyc08g077060（SlLOL1）獲得突變體。首先設計兩個gRNAs靶定exon 2，兩者相距91 bp；然后遺傳轉化番茄MP1，經(jīng)陽性苗篩選，檢測，最終獲得4類突變體lol1CR-25，lol1CR-43，lol1CR-57與lol1CR-58，或缺失，或插入，經(jīng)T1與T2代測序驗證獲得純合突變體（圖 6.a，b）。
與MP1相比，突變體幼果顏色明顯變淺，尤其是近端肩區(qū)（圖6.c）；并且無論是近端區(qū)還是遠端區(qū)，果實中葉綠素含量顯著降低（圖 6.d，e）。然而，在成熟葉片中葉綠素含量沒有變化，SlLOL1以果實特異性方式調控葉綠素含量。為了檢測葉綠素含量降低是否是由葉綠體變小所致，作者分析了lol1CR-43與MP1幼果近肩區(qū)果皮中葉綠體面積與數(shù)目。結果顯示，lol1CR-43中葉綠體顯著變小，也就是說突變體中葉綠體面積與數(shù)目明顯低于MP1（圖 6.g,h）。
圖?6. CRISPR/Cas9敲除番茄基因SlLOL1導致幼果葉綠素含量降低
pc1與pc10?互作影響辣椒幼果葉綠素含量
為分析pc1與pc10對葉綠素含量的影響，本研究利用QTL-NILs 1976，1975與1973（分別突變pc1，pc10以及pc1pc10）進行比較分析。與1154相比，NIL-1975 and NIL-1976 葉綠素含量分別降低49%與41%，而NIL-1973降低33%；雙QTL突變NIL-1973效應比期望值（90%）顯著小，暗示pc1與pc10間的互作呈現(xiàn)非加性效應（圖7.a，b）
為檢測CcLOL1與CaGLK2表達水平是否相互影響，作者分析了不同NILs在幼果發(fā)育的兩個時期CcLOL1與CaGLK2以及CcAPRR2與CcMIP1的表達情況。結果顯示，CcLOL1的表達水平不受CaGLK2?(NIL 1975)突變的影響，并且在NILs 1976與973中表達水平相似；相似地，CaGLK2的表達不受CcLOL1與CcMIP1?(NIL 1976)突變的影響，并且在NILs 1975與1973中表達水平相似；這些結果暗示了CcLOL1與CaGLK2的表達彼此獨立。CcAPRR2在NILs 1975與1973授粉后30天表達上調，但是在NIL 1976中不受影響，暗示CaGLK2對CcAPRR2有抑制作用。需要說明的是，?CcMIP1與CcLOL1緊密連鎖（相距77 Kbp），因此兩個基因突變等位一起被回交到NILs 1973與1976中。此外，CcMIP1僅在NILs 1973與1976授粉30天后上調表達，且在混池間呈現(xiàn)相似表達模式，說明此基因表達不受CaGLK2影響。
圖?7. pc1與pc10-NILs幼果葉綠素含量（分別突變CcLOL1與CaGLK2）.
結論
1. CcLOL1即為pc1靶標基因，調控辣椒果實中葉綠體大小與葉綠素含量變異
2. CcLOL1主要調控C. chinense幼果果色變異，而對于C. annuum調控能力有限
3. CcLOL1，CaGLK2與CcAPRR2是高度分化的并與C. chinense與C. annuum var glabriusculum幼果果色相關
4. pc1與pc10功能彼此互補，而CcLOL1與CaGLK2的表達互不影響
研究思路總結
利用近等基因系與輪回親本雜交獲得F2，然后混池測序，即BSA-Seq與BSR-Seq，結合候選區(qū)域交換單株篩選，尋找重組斷點，轉錄組分析差異表達基因，分析與目標性狀相關候選基因，同時分析品種間候選基因序列變異與表型變異之間的關聯(lián)性，接著，CRISPR敲除候選基因驗證功能，最后，考察表型相關指標與QTL或基因互作模式之間的相關性。
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參考文獻：
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Brand, A., Borovsky, Y., Meir, S. et al.?(2012) pc8.1, a major QTL for pigment content in pepper fruit, is associated with variation in plastid compartment size. Planta, 235, 579-588.
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