Ps:李順昌教授團(tuán)隊多次合作利用轉(zhuǎn)錄組測序全面精準(zhǔn)揭示糖尿病相關(guān)發(fā)病機(jī)制和治療策略，其實驗方案設(shè)計值得大家借鑒參考。

研究背景

心臟重構(gòu)和功能障礙是糖尿病常見的并發(fā)癥，常導(dǎo)致嚴(yán)重的心血管事件。MOTS-c是一種線粒體衍生肽，通過加速葡萄糖攝取和提高胰島素敏感性來調(diào)節(jié)代謝穩(wěn)態(tài)。目前發(fā)現(xiàn)，MOTS-c不僅可改善心臟與血管內(nèi)皮功能，且其含量在糖尿病患者血漿中明顯下降，使其成為糖尿病心血管并發(fā)癥的一個新的治療靶點。所以，該研究旨在探究MOTS-c對糖尿病心臟結(jié)構(gòu)與功能的影響并利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)挖掘其中的分子機(jī)制。

材料方法

對照組（C，n?= 10）和糖尿病前組（PD，n?= 30）。PD組的大鼠服用含有67%正常顆粒、10%豬油、20%蔗糖、2%膽固醇和1%膽酸鈉（16）的高脂肪飲食7周，糖尿病大鼠被隨機(jī)分為兩組：（1）糖尿病組（未經(jīng)治療）（D），（2）用MOTS-c（M）治療的糖尿病大鼠，取對照組（C）、未治療組（D）、治療組（M）大鼠心臟組織，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）。

研究思路

研究結(jié)果

1. MOTS-c顯著降低糖尿病空腹血糖與胰島素抵抗

MOTS-c治療8周后，D組和M組大鼠體重低于C組（圖1a和圖1e）。與D組相比，M組大鼠空腹血糖水平降低（圖1b）。此外，與C組相比，D組和M組大鼠胰島素水平下降，D組和M組間胰島素水平無顯著差異（圖1c）。通過計算HOMA-IR指數(shù)評估胰島素抵抗。與C組相比，D組大鼠的HOMA-IR指數(shù)顯著升高，而M組大鼠HOMA-IR指數(shù)較D組降低。

圖1. MOTS-c干預(yù)后各組大鼠空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR與體重的變化

2. MOTS-c有效改善糖尿病心臟結(jié)構(gòu)和功能

該研究利用透射電鏡測定了MOTS-c對糖尿病心肌超微結(jié)構(gòu)的影響。糖尿病引起心肌纖維排列紊亂和線粒體結(jié)構(gòu)的異常改變，包括心肌細(xì)胞排列不規(guī)則、嵴破裂、腫脹和空泡化（圖2）。MOTS-c治療糖尿病大鼠顯著降低心肌線粒體損傷，改善心肌纖維和線粒體結(jié)構(gòu)（圖2）。研究還通過測定檸檬酸合酶的活性，測定了線粒體功能。D組大鼠檸檬酸合酶的活性顯著降低，C組和M組的檸檬酸合酶的活性無統(tǒng)計學(xué)差異（圖3g）。

使用M型超聲心動圖測定大鼠心臟功能。D組大鼠LVPWd值明顯升高，提示左心室出現(xiàn)病變（圖3d）。與C組相比，D組大鼠EF值下降（圖3b），提示糖尿病對照組大鼠心臟收縮功能受損。D組糖尿病大鼠的E峰值和A峰值均下降，而A峰值下降更快，因此增加了E/A比值（圖3c、3e和3f）。M組和C組在EF、E/A、LVPWd、E峰值和A峰值方面均無差異（圖3b-3f），表明MOTS-c心臟舒張功能和收縮功能。

圖2. 各組大鼠心肌組織透射電鏡圖像

圖3. 各組大鼠超聲心動圖影像與數(shù)據(jù)統(tǒng)計

3. 差異表達(dá)基因的篩選

為了進(jìn)一步探究糖尿病大鼠對MOTS-c的適應(yīng)性反應(yīng)的機(jī)制，研究者利用RNA-Seq技術(shù)，測定了心肌組織基因全長轉(zhuǎn)錄表達(dá)。以C組為對照，D組表現(xiàn)出的差異表達(dá)基因（DEGs）即致病基因，再以D組為對照組篩選出M組的差異表達(dá)基因，二者篩選出的DEGs中重疊的基因即為MOTS-c改變的致病基因。將以上步驟執(zhí)行，篩選出47個MOTS-c改變的致病基因（圖4a）。將這47個基因進(jìn)行熱圖分析后發(fā)現(xiàn)，C組基因表達(dá)趨勢與D組相反，而與M組近似（圖4b）。

圖4. 差異表達(dá)基因的篩選

4.差異表達(dá)基因的功能富集分析

采用Gene Ontology（GO）與Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）對MOTS-c所改變的47個致病基因進(jìn)行功能富集分析。GO 注釋系統(tǒng)包含三個主要分支，即：生物學(xué)過程（BP）、分子功能（MF）和細(xì)胞組分（CC）。）8 周 MOTS-c 注射所改變的 47 個糖尿病致病基因共富集于 195 個 GO term 中，其中 188 個 term 富集于 BP，2 個 term 富集于 CC，5 個 term 富集于MF。經(jīng)過 ClueGO 聚類分析后，195 個 term 主要富集于 9 個類別（見圖 5b），分別為血管生成（angiogenesis）、凋亡過程調(diào)控（regulation of the apoptotic process）、MAPK 級聯(lián)調(diào)控（regulation of MAPK cascade）、蛋白激酶活性正調(diào)控（positive regulation of protein kinase activity）、脂肪酸代謝過程（fatty acid metabolic process）、吞噬作用調(diào)節(jié)（regulation of phagocytosis）、蛋白激酶 B 信號正調(diào)控（positive regulation of protein kinase B signaling）、ERK1/2 級聯(lián)（regulation of ERK1/2 cascade）、膠質(zhì)生成（gliogenesis）和白細(xì)胞介素-1 的產(chǎn)生（interleukin-1 beta production）。KEGG通路富集分析顯示，18條KEGG通路顯著富集（圖5b），其中5條信號通路與免疫、凋亡和糖代謝相關(guān)（ErbB信號通路、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)、c型凝集素受體信號通路、PI3K-Akt信號通路和AGE-RAGE信號通路）。在功能富集通路注釋基因中，ALOX15、ATF3、CCN1、EGR1、EGR3、ERRFI1、THBS1、TLR2和NRG1高頻率注釋。CCN1與EGR1基因高表達(dá)，同時均注釋在凋亡相關(guān)的GO term中，而CCN1也注釋于富集顯著性最高的ERK1/2級聯(lián)通路中，表明CCN1、ERK1/2與EGR1可能是相互關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵基因。

圖5. GO與KEGG功能富集分析

5. MOTS-c對CCN1 / ERK1/2 / EGR1信號通路的影響

為了驗證CCN1、ERK1/2與EGR1是否在MOTS-c改善糖尿病心臟結(jié)構(gòu)與功能中發(fā)揮重要作用，也為了進(jìn)一步探究MOTS-c對線粒體發(fā)生的作用，研究者利用RT-PCR與Western Blotting技術(shù)測定了CCN1、ERK1/2、EGR1的基因表達(dá)與蛋白表達(dá)以及線粒體發(fā)生標(biāo)志蛋白PGC-1α的蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，MOTS-c治療后，糖尿病大鼠心肌中PGC-1α蛋白表達(dá)顯著上升（圖7a）；CCN1、ERK1/2和EGR1基因表達(dá)顯著降低（圖6）；CCN1、EGR1蛋白表達(dá)顯著降低，ERK1/2的總蛋白表達(dá)量不變（圖7），但多個研究表明MOTS-c僅影響ERK1/2的磷酸化水平。

圖6. 各組大鼠心肌中CCN1、ERK1/2與EGR1的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)

研究結(jié)論

為期8周的MOTS-c治療減少了糖尿病患者的心功能障礙與線粒體損傷，MOTS-c可能是通過調(diào)節(jié)脂肪酸代謝、免疫調(diào)節(jié)、血管生成和細(xì)胞凋亡產(chǎn)生作用。CCN1/ERK1/2/EGR1的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能在MOTS-c抑制心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。

參考文獻(xiàn)

Manda Wang, Gangqiang Wang, Shunchang Li, et al. MOTS-c repairs myocardial damage by inhibiting the CCN1/ERK1/2/EGR1 pathway in diabetic rats. Front. Nutr., 04 January 2023Sec.

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