英文名:Multi-omics reveals functional genomic and metabolic mechanisms of milk production and quality in dairy cows

雜志：Bioinformatics，2020

影響因子：5.61

研究背景

提高人類不可食用的農(nóng)作物副產(chǎn)品的利用率是維持畜牧業(yè)可持續(xù)性的當(dāng)務(wù)之急，在過去的幾十年中，已經(jīng)做出了許多努力來利用農(nóng)作物副產(chǎn)品作為飼喂奶牛的飼料來源。但是，與高質(zhì)量和高成本的牧草苜蓿干草（AH）相比，大多數(shù)農(nóng)作物副產(chǎn)品，例如玉米秸稈（CS，是玉米生產(chǎn)的副產(chǎn)品），營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較低，通常會(huì)降低牛奶產(chǎn)量和品質(zhì)。許多研究已經(jīng)使用化學(xué)分析來評(píng)估這些飼料的營(yíng)養(yǎng)成分，消化，利用率，微生物發(fā)酵的差異及其對(duì)牛乳生產(chǎn)的影響。最近，基于組學(xué)的技術(shù)也已被用于了解飼喂CS日糧的母牛在分子水平上的生理和生物學(xué)變化。但是，牛奶的生產(chǎn)過程可能會(huì)受到多個(gè)器官/組織的影響和調(diào)節(jié)。對(duì)不同器官中復(fù)雜的牛奶生產(chǎn)生物學(xué)過程的總體調(diào)節(jié)機(jī)制缺乏全面的了解，無法獲得更可實(shí)現(xiàn)的結(jié)果。

研究目的

提高反芻動(dòng)物對(duì)人類不可食用的農(nóng)作物副產(chǎn)品的利用，以生產(chǎn)供人類消費(fèi)的優(yōu)質(zhì)牛奶是一項(xiàng)新興的全球性任務(wù)。我們進(jìn)行了一項(xiàng)基于多組學(xué)的研究，以了解奶牛飼喂低品質(zhì)農(nóng)作物副產(chǎn)品時(shí)牛奶生產(chǎn)的調(diào)控生物學(xué)過程，旨在提高其利用率。

材料方法

1、實(shí)驗(yàn)樣本：

（1）養(yǎng)殖條件：16頭中國(guó)荷斯坦奶牛（產(chǎn)奶量=29.4±2.16kg/d;日產(chǎn)奶量=164±27.5d;均價(jià)=3.6±1.8;平均±SD）。根據(jù)牛奶產(chǎn)量，在隨機(jī)分組設(shè)計(jì)中將其分配給以下2種處理方法之一：苜蓿干草為主的日糧（AH，n=8）和玉米秸稈基礎(chǔ)飲食（CS，n=8）。AH和CS日糧含有52.9％和54.3％的干物質(zhì)（DM），16.7％和16.2％的粗蛋白（以DM為基準(zhǔn)），31.1％和36.3％的中性洗滌劑纖維（以DM為基準(zhǔn)），18.5％和19.5％的酸性洗滌劑纖維（以DM為基礎(chǔ)），非纖維狀碳水化合物（NFC，DM為基礎(chǔ)）分別占40.6％和36％。每天在06:30、14:00和20:00h隨意飼喂3次，每次3至5％的飼料，使用混合飼料。

所有母牛都被喂食65天以收集生物流體樣本（瘤胃液，血清，牛奶和尿液）。在這項(xiàng)研究中測(cè)量了這16頭母牛的血液參數(shù)，瘤胃氨氮和揮發(fā)性脂肪酸。其中，考慮到動(dòng)物屠宰和多組學(xué)測(cè)量的成本，按照公開的方法從每組中隨機(jī)選擇6頭母牛進(jìn)行屠宰后再喂養(yǎng)25天以收集肝臟和MG組織。使用SAS的PROCTTEST（版本9.4）分析瘤胃發(fā)酵參數(shù)，血液參數(shù)，瘤胃微生物多樣性和功能數(shù)據(jù)。

（2）樣本收集：收集飼喂65天的16頭牛生物流體樣本（瘤胃液，血清，牛奶和尿液）和血液；再喂養(yǎng)25天后從每組中隨機(jī)選擇6頭母牛進(jìn)行屠宰以收集肝臟和MG組織。測(cè)量16頭母牛的血液參數(shù)，瘤胃氨氮和揮發(fā)性脂肪酸。

2、實(shí)驗(yàn)方法：

（1）代謝組學(xué)：肝臟和MG組織，GC-TOF/MS。

（2）宏基因組：瘤胃微生物組，IlluminaMiSeq。

（3）轉(zhuǎn)錄組：肝臟和MG組織轉(zhuǎn)錄組分析。

研究結(jié)果

1、飼喂基于AH和CS的日糧的奶牛之間的表型變化

與優(yōu)質(zhì)飼草（苜蓿干草）相比，以低品質(zhì)CS喂養(yǎng)母牛時(shí)，觀察到的牛奶產(chǎn)量，牛奶蛋白，乳糖和牛奶效率顯著降低。對(duì)血液中葡萄糖濃度的后續(xù)分析顯示，CS組的血糖濃度顯著低于AH組（P=0.03）（表1）。在飼喂CS的牛的瘤胃中，乙酸與丙酸酯的比例和氨氮的濃度均顯著較高（P<0.01）（表1）。在CS喂養(yǎng)的動(dòng)物中，乙酸鹽和丙酸鹽的瘤胃摩爾比例分別顯著較高和較低（P<0.01）（表1）。

Table 1. The blood and rumen fermentation parameters in the dairy cows fed with alfalfa hay and corn stover based diets.

2、根據(jù)宏基因組學(xué)，AH組和CS組之間瘤胃微生物組的組成和功能差異

從瘤胃微生物群中鑒定出總共784屬，包括古細(xì)菌，細(xì)菌和真核生物，在所有動(dòng)物中共檢測(cè)到其中的111屬。進(jìn)一步的比較表明，變形桿菌，纖維桿菌和門菌（圖1a）和擬桿菌，副細(xì)菌，纖維桿菌，卟啉單胞菌，Paludibacter和Victivallis屬的相對(duì)豐度顯著較高（P<0.05），而在飼喂CS的奶牛的瘤胃中，密螺旋體屬和琥珀酸單胞菌屬明顯降低（P<0.05，相對(duì)豐度>0.02％）（圖1b）。在396種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌中（相對(duì)豐度>0.01％，補(bǔ)充表2），麥芽螺旋體僅在AH組的瘤胃中發(fā)現(xiàn)，而在CS喂養(yǎng)的牛瘤胃中，T.saccharophilumandT.succinifaciens的相對(duì)豐度顯著降低（P<0.05）。在兩組奶牛的屬或種水平上，古細(xì)菌和真核生物的豐度均未發(fā)現(xiàn)差異。宏基因組功能分析揭示了兩組在1級(jí)基因功能中碳水化合物代謝的相對(duì)相對(duì)豐度不同（圖1c，P=0.032）。碳水化合物代謝中第4級(jí)功能的比較表明，編碼乳醛還原酶（EC1.1.1.77），I型谷氨酰胺合成酶（EC6.3.1.2），甲基丙二酰輔酶A脫羧酶（EC4.1.1.41），琥珀酸的基因相對(duì)豐富CS組的脫氫酶（EC1.3.5.1）和α-木糖苷ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白顯著降低（圖1d，P<0.05）。

Figure 1. Rumen microbial difference between AH and CS groups

3、基于代謝組學(xué)和代謝組學(xué)綜合分析的AH和CS組瘤胃微生物代謝特征差異

瘤胃液中55種明顯不同的代謝產(chǎn)物中，CS喂養(yǎng)的動(dòng)物中49種的代謝產(chǎn)物含量較低，通過將微生物分類群相對(duì)豐度，碳水化合物代謝中的基因豐度和17種高度豐富的微生物代謝物相關(guān)聯(lián)，研究了微生物代謝物與微生物之間的關(guān)系。核心宏基因組相關(guān)元素包括三個(gè)細(xì)菌屬（纖維桿菌，琥珀酸桿菌和螺旋體）），三種細(xì)菌種類（解淀粉琥珀酸桿菌，琥珀酸梅毒螺旋體和嗜糖鏈球菌）和三種微生物功能（甲基丙二酰輔酶A脫羧酶，琥珀酸脫氫酶和乳醛還原酶）（圖2a）。琥珀酸脫氫酶基因和解淀粉鏈球菌的相對(duì)豐度分別與16種代謝物（r介于0.43至0.68，P<0.1）和15種代謝物（r介于0.43至0.76，P<0.1）呈正相關(guān)。對(duì)上述瘤胃代謝組和代謝組的綜合分析顯示，當(dāng)給動(dòng)物喂食CS時(shí)，瘤胃中產(chǎn)生較低的丙酸根和較高的乙酸鹽的潛在機(jī)理（圖2b）。

Figure 2. Rumen microbial metabolic signature difference between AH and CS groups based on the metagenome-metabolome integrated analysis.

4、菌體和屬水平的微生物分類學(xué)分析

代謝物譜分析分別在肝臟和MG組織中鑒定出270和273種代謝產(chǎn)物（重疊179種）。肝臟中28種代謝產(chǎn)物的豐度差異顯著（VIP>1＆P<0.05）；在CS喂養(yǎng)的動(dòng)物中，其中15個(gè)較低，而13個(gè)則較高（VIP>1＆P<0.05）。在飼喂CS的動(dòng)物中，MG組織中3種代謝物含量較低，而6種代謝物含量較高（VIP>1＆P<0.05）。圖3顯示了ROC曲線分析的肝臟和MG組織中AUC最高的前3種代謝產(chǎn)物及其在AH和CS組中的相對(duì)濃度。肝臟中的馬尿酸（HCA，AUC=1，log2FC=7.54；圖3a），亮氨酸（AUC=1，log2FC=11.01;圖3b），胱氨酸（AUC=0.972，log2FC=-4.24;圖3c）表現(xiàn)出最*的預(yù)測(cè)性能，可以區(qū)分AH和CS。

MG中的馬來酸（AUC=0.972，log2FC=-2.88;圖3d），鄰苯三酚（AUC=0.833，log2FC=6.26;圖3e）和琥珀酸（AUC=0.833，log2FC=-3.01;圖3f）是分離AH和CS動(dòng)物的潛在生物標(biāo)記。通過IPA識(shí)別，CS喂養(yǎng)的奶牛的肝臟中關(guān)鍵顯著下調(diào)的途徑是氨基酸（AA）代謝（P=1.66E-07，Z評(píng)分=-3.12），糖異生（P=3.86E-08，Z評(píng)分=-2.61））以及肝臟中的維生素和礦物質(zhì)代謝（P=1.47E-15，Z分?jǐn)?shù)=-2.42）（圖3g）；MG中AAs的攝取（P=1.49E-08，Z分?jǐn)?shù)=-2.77），攝取L-AA（P=4.52E-07，Z分?jǐn)?shù)=-2.41），碳水化合物代謝（P=2.10E-11，Z分?jǐn)?shù)=-2.24）和葡萄糖-6-磷酸的氧化（P=1.01E）-11，Zscore=-2.21）途徑顯著下調(diào)。（圖3h）

Figure 3. The biomarker and functional analysis in the liver and mammary gland tissues between AH and CS groups.

5、AH和CS組之間差異表達(dá)的基因和功能分析

分別從肝臟和MG轉(zhuǎn)錄組中分別獲得22.63±1.95和20.03±271萬原始序列讀數(shù)?；虮磉_(dá)的密度在每個(gè)組織內(nèi)的飲食處理之間沒有顯示出明顯的差異，但是在兩個(gè)組織之間存在顯著的差異。在AH和CS組之間，總共在肝臟中發(fā)現(xiàn)了67個(gè)基因（CS組中9個(gè)上調(diào)和58個(gè)下調(diào)）DE基因（|倍數(shù)變化|>2＆FDR<0.05）（圖4a）。在CS奶牛的MG中，兩個(gè)基因（IGFBP1和ENSBTAG00000047957）以及六個(gè)基因（包括PDZK1IP1，LALBA，CSN1S2，LOC505033，CSN3和PDPN）分別顯著上調(diào)和下調(diào)（圖4b）?；贒E基因，在AH和CS組之間分別在肝臟和MG組織中鑒定出165個(gè)和19個(gè)功能性GO術(shù)語。

Figue 4. The differential expressed genes between AH and CS groups and coexpressed gene module-biomarker correlation analysis in the liver and mammary gland tissues.

6、代謝機(jī)制的確定作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分配的結(jié)果

在兩個(gè)動(dòng)物組之間，AA代謝途徑是肝臟中最顯著不同的途徑（圖5a）。對(duì)AA代謝途徑的進(jìn)一步影響分析表明，亞途徑，甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝的影響較大（圖5b，P=0.029，影響值=0.597）。因此，我們對(duì)肝臟中與甘氨酸相關(guān)的反應(yīng)進(jìn)行了徹底的分析，并研究了它們與體內(nèi)體液中代謝物的關(guān)系。綜合比較表明，苯甲酸，糖胺（GAA）和HCA在整個(gè)人體的AA代謝中起著關(guān)鍵作用，當(dāng)母牛飼喂CS時(shí)，隨后會(huì)影響牛奶的合成（圖5c）。用CS喂養(yǎng)的奶牛肝臟中甘氨酸和HCA的濃度更高，進(jìn)一步支持了我們的推測(cè)，即瘤胃（微生物）和肝臟（宿主）中的苯甲酸代謝都可能受到影響（圖5c）。對(duì)肝，血清和尿液進(jìn)行的HCA生物標(biāo)志物分析顯示出一致的結(jié)果（圖5d），這進(jìn)一步表明，從肝臟到尿液的HCA循環(huán)是CS下牛奶產(chǎn)量變化的生物標(biāo)志物。

Figure 5. The roles of systematic metabolites across multiple organs and biofluids when cows fed corn stover 。

文章創(chuàng)新點(diǎn)

這項(xiàng)研究揭示了低質(zhì)飼草飲食下跨不同生物流體和組織的與牛奶生產(chǎn)相關(guān)的生物學(xué)機(jī)制，這為未來作物副產(chǎn)品的利用和可持續(xù)反芻動(dòng)物的生產(chǎn)提供了新穎的理解和潛在的改善策略?？傊瑢?duì)瘤胃，肝臟和MG組織中不同分子（DNA，RNA，代謝物）的多組學(xué)評(píng)估表明，當(dāng)給母牛喂食CS時(shí)，乳牛生產(chǎn)中所涉及的代謝和分子生物學(xué)機(jī)制。對(duì)高品質(zhì)和低品質(zhì)飼料來源的奶牛進(jìn)行系統(tǒng)的比較，為提高人類不可食用的飼料用于牛奶生產(chǎn)的生物利用度提供了基本的了解。已發(fā)現(xiàn)馬尿酸是導(dǎo)致牛奶產(chǎn)量低的代謝生物標(biāo)志物，暗示了與低質(zhì)飼草利用代謝機(jī)制有關(guān)的未來評(píng)估參數(shù)，在開發(fā)用于繁殖和選擇或分類動(dòng)物的工具以優(yōu)化農(nóng)場(chǎng)管理方面，這是有希望的。