1.1?植物組織：CTAB法

1. 液氮研磨樣品，分裝至離心管中
2. 向離心管中加入 CTAB，水浴
3. 離心后向上清中加入氯仿/異戊醇（24:1），離心
4. 向上清中加入異丙醇和乙酸鈉溶液，離心，棄上清
5. 加入 75％乙醇，離心，棄上清
6. 晾干，加入 TE ?溶解 DNA ，保存在-20℃冰箱

1.2?動(dòng)物組織：SDS法

1. 液氮研磨組織樣，分裝至離心管中
2. 加入 SDS 溶液，水浴
3. 加入 NaCl 溶液，靜置后離心
4. 向上清中加入氯仿/異戊醇（24:1）后離心
5. 向上清中加入異丙醇后離心，棄上清
6. 加入 75％乙醇，離心，棄上清
7. 晾干，加入 TE 溶解 DNA，保存在-20℃冰箱

1.3?動(dòng)物血液：Kurabo 試劑盒法

QuickGene DNA whole blood kit S (DB-S)，廠家：Kurabo，貨號(hào)：40321300101

1.4?粗體核酸純化

試劑盒名稱：QIAGEN Genomic-tip 20/G，廠家：QIAGEN，貨號(hào)：10223

試劑盒名稱：QIAGEN Genomic-tip 100/G，廠家：QIAGEN，貨號(hào)：10243

1.5?微生物樣本

使用TGuide S96磁珠法土壤/糞便基因組DNA提取試劑盒完成核酸的提取

2、檢測(cè)方法

2.1?檢測(cè)方法

• 濃度檢測(cè)

Nanodrop：賽默飛 Thermo ，型號(hào) NANODROP2000

Qubit：廠家YEASEN, 型號(hào)CAT 12642-A ，試劑1XdsDNA HS Assay kit for Qubit

• 完整性檢測(cè)（瓊脂糖凝膠電泳）

電泳儀：廠家：天能 Tanon ，型號(hào) EPS600

電泳槽：廠家：天根生化科技（北京）有限公司，型號(hào)：HE- 120

2.2?判定標(biāo)準(zhǔn)

• 總量≥6μg（單次建庫(kù)）
• 濃度≥100ng/ul
• 體積≥10(ul)
• OD260/280在7-2.2之間，OD260/230在1.5-3.0之間
• AGE：size≥23K，降解條帶>5K，點(diǎn)樣孔無(wú)或有輕微污染，N/Q≤2
• 樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格

注：特殊物種實(shí)驗(yàn)人員會(huì)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行判斷，具體以檢測(cè)報(bào)告中的判斷結(jié)果為準(zhǔn)

3、建庫(kù)方法

3.1?建庫(kù)流程

1. 準(zhǔn)備高質(zhì)量核酸，g-TUBE 管使核酸片段化
2. 使用BluePippin進(jìn)行片段篩選
3. 使用 NEBNext FFPE DNA Repair Mix 和 NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module 完成核酸片段的損傷修復(fù)和末端修復(fù)加 A
4. 使用無(wú)擴(kuò)增條形碼擴(kuò)展試劑盒添加 barcode 序列
5. 使用無(wú)擴(kuò)增條形碼擴(kuò)展試劑盒完成測(cè)序接頭的連接

3.2?建庫(kù)試劑

• 文庫(kù)構(gòu)建試劑：NEBNext FFPE DNA Repair Mix貨號(hào)?M6630L 廠家?NEB
• 文庫(kù)構(gòu)建試劑：NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module貨號(hào)E7546L ?廠家NEB
• 文庫(kù)構(gòu)建試劑：無(wú)擴(kuò)增條形碼擴(kuò)展試劑盒1-96 ?貨號(hào)SQK-NBD114.96 廠家Nanopore

3.3?建庫(kù)設(shè)備

• 數(shù)字 3*32PCR 儀??廠家?Appliedbiosystems???儀器規(guī)格?proflex3*32
• 制冷型程控五段金屬浴??廠家?天根生化科技（北京）有限公司??儀器規(guī)格?OSE-DB-02

4、測(cè)序方法

4.1?上機(jī)操作

1. 用測(cè)序芯片制備試劑盒配制 Flow cell Priming mix
2. 用測(cè)序輔助擴(kuò)展試劑盒配置上機(jī)文庫(kù)
3. 用 PromethION ?Flow ?Cells 芯片，在PromethION48測(cè)序儀運(yùn)行MinKnow 軟件，開(kāi)始測(cè)序，默認(rèn)運(yùn)行72 小時(shí)

4.2?測(cè)序試劑

• 測(cè)序芯片制備試劑盒??貨號(hào)?EXP-FLP004 ??廠家?Nanopore
• 測(cè)序輔助擴(kuò)展試劑盒??貨號(hào)?EXP-AUX003 ?廠家?Naonopore
• 測(cè)序芯片??PromethION Flow Cell(R10.4.1)??貨號(hào)?FLO-PRO114M ??廠家?Nanopore

4.3?測(cè)序設(shè)備

PromethION48 測(cè)序儀??廠家?Nanopore???儀器規(guī)格?PromethION48

ONT測(cè)序技術(shù)在多個(gè)方面具有非常強(qiáng)悍的優(yōu)勢(shì)，然而，一份合格的下機(jī)數(shù)據(jù)才是科研成功研究的基礎(chǔ)，為保證得到準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄組結(jié)構(gòu)分析和定量結(jié)果，需要對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)控評(píng)估。那么我們今天一起學(xué)習(xí)一下《Summary statistics and QC tutorial》，ONT官方提供的對(duì)測(cè)序raw?data進(jìn)行全面數(shù)據(jù)質(zhì)控的教程。

介紹

此教程適用于指導(dǎo)對(duì)單個(gè)nanopore測(cè)序芯片產(chǎn)出的數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估，評(píng)估的主要內(nèi)容如下所示：

1、測(cè)序產(chǎn)出（測(cè)序得到多少reads，多大數(shù)據(jù)量）；

2、測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量和長(zhǎng)度分布；

3、如果加入了barcode序列進(jìn)行混樣建庫(kù)，測(cè)序數(shù)據(jù)在不同樣品的分布。

準(zhǔn)備

直接到教程的github頁(yè)面下載或通過(guò)git命令下載：

git clone https://github.com/nanoporetech/ont_tutorial_basicqc.git QCTutorial

后續(xù)分析會(huì)用到下載目錄QCTutorial下的以下內(nèi)容：

1) Nanopore_SumStatQC_Tutorial.Rmd：Rmarkdown文件，說(shuō)明文檔和用于執(zhí)行分析。

2) RawData/lambda_sequencing_summary.txt.bz2：示例文件，Guppy對(duì)測(cè)序reads進(jìn)行堿基識(shí)別生成的相關(guān)信息文件。

3) RawData/lambda_barcoding_summary.txt.bz2：示例文件，用于區(qū)分混樣建庫(kù)時(shí)多樣品的barcode信息。

4) environment.yaml：指定分析所需軟件包及計(jì)算環(huán)境的文本文檔。

5) config.yaml：配置文件，用于指定分析所需的輸入。

2、創(chuàng)建Conda環(huán)境

為了方便執(zhí)行分析所需軟件包及其依賴的安裝及管理，需要安裝Conda并創(chuàng)建用于此分析的環(huán)境。

1)?Conda安裝（Python3版本的Miniconda）：

wget https://repo.anaconda.com/miniconda/Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh

bash Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh

bash

2)?創(chuàng)建Conda環(huán)境及環(huán)境激活（第1步中下載的environmen.yaml用于環(huán)境初始化）：

創(chuàng)建環(huán)境：conda env create –name BasicQC –file environment.yaml

激活環(huán)境：source activate BasicQC

分析

進(jìn)行分析之前需先準(zhǔn)備配置文件，通過(guò)修改準(zhǔn)備步驟下載的config.yaml中相應(yīng)的參數(shù)來(lái)完成，需要修改的內(nèi)容主要有：

注：如為單樣品測(cè)序無(wú)barcode信息，則barcodeFile部分為空。

準(zhǔn)備完成后，可以通過(guò)命令行啟動(dòng)分析，命令如下：

R –slave -e ‘rmarkdown::render(“Nanopore_SumStatQC_Tutorial.Rmd”, “html_document”)’

如果習(xí)慣圖形界面操作，也可以通過(guò)Rstudio載入Rmarkdown文件執(zhí)行分析：

結(jié)果

上述分析完成后會(huì)將分析結(jié)果存放至HTML文件，可用瀏覽器打開(kāi)Nanopore_SumStatQC_Tutorial.html進(jìn)行查看。對(duì)單個(gè)芯片約1M reads分析的部分結(jié)果展示如下（結(jié)果來(lái)自教程，堿基識(shí)別使用Guppy 2.1.3，根據(jù)識(shí)別序列的平均質(zhì)量值將其分為pass和fail兩種，質(zhì)量值閾值默認(rèn)為7）：

1、總結(jié)

展示了數(shù)據(jù)產(chǎn)出的總體情況（如下圖，本分析中堿基識(shí)別共產(chǎn)出991,715條序列，14.6G堿基）。

2、質(zhì)量長(zhǎng)度

此部分展示了對(duì)識(shí)別出的所有序列質(zhì)量和長(zhǎng)度信息的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，包括序列的平均長(zhǎng)度，N50和平均質(zhì)量，序列長(zhǎng)度和質(zhì)量的密度分布等

3、測(cè)序表現(xiàn)

此部分內(nèi)容統(tǒng)計(jì)了隨測(cè)序時(shí)間變化，測(cè)序累計(jì)序列個(gè)數(shù)，堿基個(gè)數(shù)，測(cè)序速度和有效工作納米孔數(shù)等指標(biāo)的變化情況。

4、區(qū)分混樣

在加入barcode序列混樣測(cè)序的情況下，barcode識(shí)別區(qū)分的結(jié)果展示如下，包括barcode識(shí)別效率，區(qū)分的文庫(kù)個(gè)數(shù)及每個(gè)文庫(kù)中序列個(gè)數(shù)占比和長(zhǎng)度信息等。

上面展示了分析結(jié)果的部分內(nèi)容，更多細(xì)節(jié)的內(nèi)容可參考底部的相關(guān)鏈接。

rawdata的質(zhì)控評(píng)估只是整個(gè)信息分析的開(kāi)始，是為了對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)有大致的整體認(rèn)識(shí)，以便更好地指導(dǎo)后續(xù)分析。然而分析的每個(gè)環(huán)節(jié)都會(huì)對(duì)最終結(jié)果產(chǎn)生影響，因此每一步的處理都要深思熟慮。

小編寄語(yǔ)

2018年8月牛津納米孔公司與百邁客公司達(dá)成長(zhǎng)期合作，擁有MinION、GridION X5和PromethION三種型號(hào)全套納米孔測(cè)序儀。至今已積累了豐富的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)，全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組成功案例先后發(fā)表在《Plant Biotechnol J》、《J Hazard Mater》、《Biotechnol Biofuels》、《Sci Rep》、《Fish & Shellfish Immunology》等國(guó)際知名期刊，已發(fā)表文章研究物種分別有楊樹(shù)、吳松草、風(fēng)箏果、甘薯、野生甘薯、兔子、跳甲、花羔紅點(diǎn)鮭和辣椒，覆蓋領(lǐng)域分別為林木、哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、水產(chǎn)和作物等。

如您有任何全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組等相關(guān)問(wèn)題，歡迎點(diǎn)擊下方按鈕，我們將竭盡全力為您答疑、設(shè)計(jì)方案和提供高分成功案例等。

參考鏈接:

https@//github.com/nanoporetech/ont_tutorial_basicqc(@換成:)

https@//community.nanoporetech.com/knowledge/bioinformatics(@換成:)