1、提取方法

1)植物葉片：（天根 DP441（廠家：天根，型號(hào)：DP441）

2)植物根、莖、種子：艾德萊 RN40（廠家：艾德萊，型號(hào)：RN40））試劑盒

3)動(dòng)物常規(guī)組織：TRIzol

4)皮膚、毛發(fā)：凱捷 217044（廠家：凱捷。型號(hào)：217004）

5)全血PAX管送樣：PAXgene Blood miRNA Kit(50)（廠家：GENENODE。型號(hào)：2145A）試劑盒

6)EDTA抗凝血：TRIzol

2、檢測(cè)方法

2.1檢測(cè)方法

使用 Nanodrop2000 （廠家：賽默飛，型號(hào) ：Nanodrop2000）對(duì)于提取的核酸進(jìn)行濃度純度檢測(cè)，并使用 LabChip GX（廠家：鉑金埃爾默，型號(hào)：LabChip GX Touch HT）對(duì)完整性進(jìn)行檢測(cè)

2.2判定標(biāo)準(zhǔn)

1)總量≥1（ug），滿足 2 次建庫(kù)

2)濃度≥20（ng/ul）

3)體積≥10(ul)

4)OD260/280 在 1.7-2.5 之間，OD260/230 在 0.5-2.5 之間，260nm 吸收峰顯示正常

5)RIN 值≥4.0（非植物），RIN 值≥4.0（植物），同時(shí)若 GX 檢測(cè) 6.0-4.0 的需結(jié)合基線判斷，28S/18S≥1 且基線無(wú)上抬或輕微上抬

6)樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格

3、建庫(kù)方法

3.1mRNA純化及打斷

1) mRNA與磁珠第一次結(jié)合

A.將 mRNA Capture Beads 置于四維旋轉(zhuǎn)儀上充分混勻，平衡 30min 后使用

B.將 mRNA Capture Beads 加入到準(zhǔn)備好的總 RNA 樣品中混勻，65℃孵育，使 RNA 變性

C.變性結(jié)束后，室溫放置 5min ，使 mRNA 結(jié)合到磁珠上

D.將樣品管置于磁力架上靜置，磁珠充分吸附到磁鐵一側(cè)后，移棄上清液

E.將樣品從磁力架上取出，用Wash Buffer 吹吸后置于磁力架上，磁珠充分吸附到磁鐵一側(cè)后，移棄上清液

F.將樣品從磁力架上取出，加入 Tris Buffer 吹吸混勻，80℃洗脫mRNA

2) mRNA 與磁珠第二次結(jié)合

A.向上步離心管中加入 Beads Binding Buffer ，吹吸混勻，室溫放置 5min ，使 mRNA 重新結(jié)合到磁珠上

B.將樣品置于磁力架上，使磁珠充分吸附到磁鐵一側(cè)，然后移棄上清液

C.將樣品從磁力架上取出，用 Wash Buffer 吹吸混勻，置于磁力架上 2min ，移棄上清液

D.將樣品從磁力架上取出，加入 Frag/Prime Buffer 并吹吸混勻

3) mRNA 的打斷

將上述 mRNA 產(chǎn)物中加入放入 PCR 儀中，根據(jù)樣品質(zhì)量等情況判定相應(yīng)的打斷條件，打斷完成后立即放在冰上。

3.2合成 cDNA 第一條鏈

向上步反應(yīng)的離心管中加入反轉(zhuǎn)錄第一條鏈所需的試劑，混勻離心后放入 PCR 儀中設(shè)定好程序進(jìn)行cDNA 第一條鏈的合成

3.3合成 cDNA 第二條鏈（含末端修復(fù)及加A尾）

向合成的 cDNA 第一條鏈產(chǎn)物中依次加入二鏈合成反應(yīng)的試劑，混勻離心后放入 PCR 儀中設(shè)定好程序進(jìn)行二鏈的合成

3.4連接接頭

向上述反應(yīng)產(chǎn)物中依次加入接頭和連接酶，金屬浴中孵育，進(jìn)行接頭連接反應(yīng)

注：Adaptor 中包含 Index 序列，使用時(shí)需嚴(yán)格按照上機(jī)調(diào)度安排的序列添加

3.5連接產(chǎn)物純化及片段選擇

1)向上述反應(yīng)產(chǎn)物加入相應(yīng)體積的（0.6X）已混勻的磁珠，混勻，室溫孵育而后置于磁力架上，待磁珠吸附到 磁力架一側(cè)后移棄上清液

2)離心管置于磁力架上，加新鮮配制的 80% ethanol ，靜置 30s ，移棄上清液

3)重復(fù)步驟 2 一次，第二次清洗后離心用 10ul 槍頭將上清液去除干凈

4)離心管置于磁力架上，打開(kāi)管蓋，空氣干燥

5)取下離心管，加入 Nuclease-free Water，混勻，室溫孵育，而后置于磁力架上靜置，吸取上清液轉(zhuǎn)入新的離 心管中

6)向上述離心管中加入（0.6X） 已混勻的磁珠，混勻，室溫孵育而后置于磁力架上

7)吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，并向該離心管中加入（0.1X）已混勻的磁珠，混勻后室溫孵育

8)孵育結(jié)束后置于磁力架上，待磁珠和上清液分開(kāi)后棄掉上清液

9)離心管置于磁力架上，加入新鮮配制的 80% ethanol，磁力架上靜置 30s，移棄上清液；重復(fù)該步驟一次

10)離心管置于磁力架上，打開(kāi)管蓋，空氣干燥

11)取下離心管，加入 Nuclease-free Water，吹吸混勻，室溫靜置；而后磁力架上靜置 ，吸取上清液轉(zhuǎn)入新的 0.2ml 離心管中

3.6PCR 擴(kuò)增

向上述離心管中加入 PCR 反應(yīng)所需的各種試劑，混勻后離心，根據(jù) PCR 反應(yīng)條件，放入 PCR 儀中進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增

3.7PCR 產(chǎn)物純化

1)瞬時(shí)離心 PCR 反應(yīng)管，加入相應(yīng)體積的磁珠，充分混勻

2)室溫孵育，然后置于磁力架上靜置，小心移除上清液

3)向反應(yīng)管中加入新鮮配制的 80% ethanol ，磁力架上靜置 30s ，移棄上清液，重復(fù)該步驟 1 次

4)打開(kāi)管蓋，磁珠干燥后加入 Nuclease-free Water 洗脫 DNA ，吹吸混勻，室溫靜置，磁力架上靜置，小心 吸取上清至新的離心管中，并分裝 1.5 μL 于新的 1.5 mL 離心管中用于片段檢測(cè)，-20℃保存

3.8文庫(kù)質(zhì)檢

文庫(kù)通過(guò) Qsep-400 方法進(jìn)行質(zhì)檢，滿足如下指標(biāo)即可上機(jī)檢測(cè)

3.9引物接頭序列

adpter3=”AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC”;

adpter5=”AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT”;

3.10建庫(kù)試劑耗材

1)文庫(kù)構(gòu)建試劑盒：Hieff NGS Ultima Dual-mode mRNA Library Prep Kit for Illumina（翌 圣），貨號(hào) 13533ES96

2)產(chǎn)物純化磁珠：HieffNGS DNA selection Beads (Superior Ampure XPalternative)（翌圣），貨號(hào) 12601ES56

3)質(zhì)檢使用試劑：Qsep400 標(biāo)準(zhǔn)DNA 卡夾

4)定量使用試劑：Qubit TM dsDNA HS Assay Ki

5)1.5ml離心管、0.2ml PCR管、10ul，200ul槍頭：Axygen

3.11建庫(kù)設(shè)備

4、測(cè)序方法

測(cè)序設(shè)備：NovaSeq X plus

測(cè)序試劑盒：NovaSeqTM X? Series25B Rgt Kit

1)樣本研磨

2)將裝有樣品的離心管加入1 ml 65 ℃預(yù)熱的CTAB提取液和2%的巰基乙醇（如 果是動(dòng)物組織的話加50ul濃度為20mg/ml的蛋白酶K），在渦旋振蕩儀上震蕩混勻，使樣品完全懸浮，65 ℃烘箱溫浴40 -60min，不能超過(guò)1h

3)溫浴期間搖勻2-3次，保證裂解充分。取出后，冷卻至室溫

4)12000 rpm離心5 min，取上清液900ul至新的2.0 ml 無(wú)菌離心管中（。加入等體積三氯甲烷/異戊醇（24:1），上下顛倒混勻， 12000 rpm離心20 min

5)吸取上清液700 ul至新的2.0 ml 無(wú)菌離心管，加入等體積三氯甲烷-異戊醇 （24:1），上下顛倒混勻， 12000 rpm離心20 min

6)吸取上清液450 ul至新的1.5 ml無(wú)菌離心管中，加入上清液體積的2/3體積（300ul）的異丙醇和1/10體積（45ul）的3M乙酸鈉，充分混勻，-20 ℃放置1 h

7)12000rpm離心10min（如果從-20℃取出后絮狀沉淀較多，可12000rpm離心20s），棄上清，瞬時(shí)離心，用200ul槍頭吸棄多余液體

8)向沉淀中加1ml 75%的乙醇溶液，輕彈至沉淀懸浮，12000rpm離心5min，棄上清

9)瞬時(shí)離心，用黃槍頭吸棄多余液體，離心管開(kāi)蓋室溫晾干3-5min至DNA沉淀呈半透明狀

10)加入≥20 ul含10 ng/ul RnaseA的超純水，根據(jù)沉淀大小決定融水體積，溶解DNA沉淀，37 ℃水浴鍋消化1 h后保存在-20 ℃冰箱備用

注：常規(guī)植物組織提取正常使用CTAB提取，疑難植物（薔薇科等多糖類植物）組織裂解前使用干擾（清洗掉部分多糖等雜質(zhì)）先清洗，清洗完之后在加裂解液；動(dòng)物組織在裂解時(shí)加入2%的蛋白酶K；宏基因組項(xiàng)目提取在裂解時(shí)加入5%-10%的溶菌酶

2、檢測(cè)方法

2.1檢測(cè)方法

使用 Qubit（廠家YEASEN, 型號(hào)CAT 12642-A ，試劑1XdsDNA HS Assay kit for Qubit ）檢測(cè)核酸濃度，使用1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)完整性

2.2判定標(biāo)準(zhǔn)

濃度≥1ng/ul

總量大于等于 30ng

完整性主帶清晰、主帶不清晰，主要彌散在2K以上，跳帶、或嚴(yán)重鋸齒狀、或“H”形或下方有非常嚴(yán)重的非RNA樣彌散等核酸狀態(tài)正常

3、建庫(kù)方法

3.1基因組打斷加樣（酶切打斷）及末端修復(fù)

1)樣品稀釋分裝

A.取基因組DNA 10ng（qubit定量）進(jìn)行建庫(kù)

B.向以上 DNA中加入以下試劑立即置于PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)

2)酶切打斷（75℃熱蓋）

3.2接頭連接

1)試劑體系

2）操作流程

A.向打斷末修加A產(chǎn)物加入以上試劑和 DNA Adapter
B.按照下述程序PCR儀上反應(yīng)

3)連接產(chǎn)物純化

用Vazyme DNA Clean磁珠對(duì)上述步驟中的PCR產(chǎn)物做0.8×磁珠純化

4)片篩純化

A.向上述產(chǎn)物中加入（0.485×）磁珠，混勻后室溫孵育5 min；而后置于磁力架上，吸取全部上清液至新的96孔板中

B.加入（0.1×）磁珠，混勻后室溫孵育5 min；而后置于磁力架上，移棄上清液

C.80%乙醇清洗磁珠兩次后移棄上清液

D.加入10 μL nuclease-free water，混勻后室溫靜置5 min；而后磁力架上，吸取8 μL上清液進(jìn)行下一步PCR擴(kuò)增

3.3PCR 擴(kuò)增

1)PCR體系

2)PCR程序

3.4PCR 產(chǎn)物純化

用Vazyme DNA Clean磁珠對(duì)上述步驟中的PCR產(chǎn)物做0.6×磁珠純化，得到合格文庫(kù)

3.5文庫(kù)質(zhì)檢

1)質(zhì)檢方法：文庫(kù)通過(guò) Qsep-400 進(jìn)行片段質(zhì)檢， 使用 Qubit 3 .0 進(jìn)行文庫(kù)濃度的定量

2)質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)：濃度≥1ng/ul， 質(zhì)檢片段中心值430-530bp， 平均值420-580bp 之間， 峰型呈正態(tài)分布， 片段單一無(wú)雜峰

3.6引物接頭序列

adpter3=”AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC”;

adpter5=”AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT”;

3.7建庫(kù)試劑耗材

1)文庫(kù)構(gòu)建試劑盒：VAHTSTM Fg DNA Library Prep Kit? for I11umina 貨號(hào)ND617-02

2)產(chǎn)物純化磁珠：VAHTSTM DNA Clean Beads， 貨號(hào)N411-03

3)質(zhì)檢使用試劑：Qsep400 標(biāo)準(zhǔn)DNA 卡夾

4)定量使用試劑：Qubit TM dsDNA HS Assay Ki

5)1.5ml離心管、0.2ml PCR管、10ul，200ul槍頭：Axygen

3.8建庫(kù)設(shè)備

4、測(cè)序方法

測(cè)序設(shè)備：NovaSeq X plus

測(cè)序試劑盒：NovaSeqTMX? Series25B Rgt Kit