研究背景

枯葉提取法是一種新型的高羊茅鎘植物修復策略，為鎘污染土壤的植物修復和清潔食品生產提供了可行性?？萑~中Cd含量最高是葉片衰老過程中Cd積累的結果。然而，葉片衰老過程中Cd積累的機理尚不清楚，這限制了該技術的提取效率。本研究通過RNA-seq組學研究技術對高羊茅葉片Cd積累的內部機制。

研究方法

根據葉片在美洲虎羊茅莖中的位置進行取樣和分離。L1為頂部初生葉，L2和L3為上部2、3個成熟葉片，L4是衰老開始時的葉片；L5是衰老的黃色葉片。

分別用75μMCd和不加75μMCd處理高羊茅幼葉(L1)和衰老葉(L4)7d(L1-con、L4-con、L1-Cd、L4-Cd)，并進行3次生物重復，提取總RNA并進行轉錄組測序。（測序工作由北京百邁客公司提供技術支持）。

研究結果

一、不同葉片中的鎘、游離氨基酸、可溶性糖和金屬硫蛋白測定

不同葉片Cd積累量顯著不同。葉片Cd濃度隨葉片數量的增加從上到下顯著增加，L2、L3、L4和L5的Cd濃度比幼葉(L1)增加了2.1、2.3、2.5和5.1倍。幼葉(L1)積累Cd最少，而衰老葉(L5)積累Cd最多。Cd處理顯著提高了各葉片游離氨基酸含量，但沒有改變其隨葉片衰老逐漸下降的趨勢，幼葉中游離氨基酸含量(L1)最高，然后隨著葉片衰老逐漸降低(圖1B)。衰老葉(L5)中游離氨基酸含量最低。成熟葉片中可溶性糖含量(L2)最高，Cd處理顯著提高了L2和L4的可溶性糖含量，然后隨著葉片衰老逐漸降低。衰老葉(L5)和幼葉(L1)的可溶性糖含量顯著低于綠色成熟葉。鎘脅迫下,與對照組相比，Cd處理顯著提高了所有葉片中的金屬硫蛋白含量，不同葉片金屬硫蛋白含量無顯著變化。

Cd脅迫對高羊茅不同葉片Cd(A)、游離氨基酸(B)、可溶性糖(C)和金屬硫蛋白(D)含量的影響

二、鎘處理對不同葉片間螯合物的影響

PC、GSH和NPT參與了超積累劑的Cd解毒機。Cd脅迫和對照組的植物螯合素(PCs)均隨葉片老化顯著增加。Cd處理顯著提高了各葉片PC含量，非蛋白硫醇(NPTs)含量也隨著葉片衰老而顯著增加，但隨葉片衰老的增加趨勢沒有變化。Cd處理顯著增加了衰老葉片(L4和L5)的谷胱甘肽(GSH)含量，但沒有提高幼苗和成熟苗的GSH含量。由此可以推斷，GSH、PC和NPT的增加及其與Cd的結合可能促進了衰老葉片中Cd的積累。Cd處理顯著增加了幼葉和成熟葉的氧化谷胱甘肽(GSSH)含量(L1和L2)，但降低了衰老葉(L5)的GSSH含量。由于氧化后的谷胱甘肽(GSSH)可被還原為還原型谷胱甘肽(GSH)，還原性谷胱甘肽(GSH)可以通過GST進一步催化GSH-Cd結合，GSSH向GSH的轉化與Cd在衰老葉片中的積累是一致的。

Cd脅迫對高羊茅不同葉片螯合素(PCs)、非蛋白硫醇(NPTs)、還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSH)含量的影響

三、差異基因的鑒定和GO分析

為了更好地了解Cd在葉片衰老過程中的積累機制，利用RNA-seq研究了Cd處理前后幼葉(L1)和衰老葉(L4)的轉錄組譜。對L1-ConvsL4-Con、L1-CdvsL4-Cd、L1-convsL1-Cd和L4-convsL4-Cd的比較組根據轉錄水平至少有兩倍差異進行篩選，分別發(fā)現的差異基因數目為2286、4270、1808、1929。在這些差異基因中，與Cd脅迫相比，L1和L4中有157個基因表達上調，255個基因表達下調。四個比較組的共有24個上調基因和20個下調基因。采用qRT-PCR方法，從RNA-seq數據的差異基因中隨機選取12個基因的表達水平進行分析。這12個基因在qRT-PCR分析結果和RNA-seq數據中均顯示出相同的表達模式。

為了了解差異基因的功能，作者進行了GO富集分析。四組的差異基因在節(jié)律過程、信號傳導和代謝過程等生物過程中都有20個豐富的分類。值得注意的是，與對照組相比，脫毒組的差異基因在幼葉和衰老葉中都有富集(L1-ConvsL1-Cd和L4-ConvsL4-Cd)，但在幼葉和衰老葉的對照組和處理組中沒有明顯富集（L1-CdvsL4-Cd和L1-ConvsL4-Con）。

鎘脅迫下幼葉和衰老葉片基因表達譜的變化

四、KEGG通路分析

為了進一步了解Cd處理下高羊茅葉片中Cd積累的機制，利用KEGG對葉片中的差異基因進行富集分析。在幼葉中，主要富集的途徑是晝夜節(jié)律-植物、苯丙氨酸代謝、植物激素信號轉導、苯丙素生物合成、淀粉和蔗糖代謝，而在衰老葉片中，差異基因主要富集于類胡蘿卜素的生物合成、晝夜節(jié)律與植物的關系、谷胱甘肽的代謝、植物與病原菌的相互作用以及苯丙素的生物合成等代謝途徑。苯丙素類生物合成和晝夜節(jié)律型植物的基因在幼葉和衰老葉中都表現豐富。值得注意的是，屬于谷胱甘肽代謝途徑的基因僅在衰老葉片中表現出富集。

差異基因的KEGG途徑富集分析

五、衰老葉片中谷胱甘肽代謝途徑與Cd結合

通過比較分析幼葉和衰老葉片對Cd脅迫的響應，有助于探索衰老葉片中Cd積累的關鍵調控基因，作者進一步比較了對照組組和Cd處理組在“谷胱甘肽代謝”途徑中的差異基因表達。谷胱甘肽-S-轉移酶(GSTs)是催化GSH-Cd偶聯的酶，植物GSTs可以進行GSH依賴的反應來進行Cd解毒。在該轉錄組中，共鑒定出了26個基因編碼GST。其中，19個上調基因在Cd脅迫下的差異倍數高于對照組。結果表明，GST基因的上調和S-谷胱甘肽的結合可能參與了衰老葉片中Cd的積累。

MT（金屬硫蛋白）是一組金屬結合蛋白，在金屬分配和穩(wěn)態(tài)中起著關鍵作用。1個上調基因(c129583.Graph_c0)和一個下調基因(c120767.graph_c0)編碼MT。Cd脅迫使上調基因的差異倍數比對照增加了23.8%，并完全抑制了表達下調的基因。結合Cd脅迫下MT含量的增加，作者的研究結果表明，MT-Cd結合可能在幼葉(L1)和衰老葉片(L4)的Cd解毒過程中發(fā)揮作用。半胱氨酸蛋白酶(CPs)是葉片衰老過程中負責蛋白水解活性的最豐富的酶。在該轉錄組中鑒定出17個編碼CP的基因。在對照組中，只有4個基因的表達有顯著差異。Cd脅迫顯著促進CP表達，有10個上調基因在Cd處理組的差異倍數高于處理組，Cd處理組的6個基因下調倍數低于對照組。然而，PC的蛋白水解活性是否與衰老葉片中Cd的積累有關尚不清楚。

與谷胱甘肽代謝和Cd結合相關的基因在幼葉(L1)和衰老葉(L4)與Cd脅迫或不脅迫下的轉錄變化

總結

從枯葉中提取Cd的策略取決于葉片衰老過程中Cd的積累機制。研究葉片衰老過程中Cd在枯葉中優(yōu)先積累的機理至關重要。本研究通過轉錄組和化學分析表明，葉片衰老過程中Cd的積累與PC、GSH和NPT結合Cd有關。Cd結合PC、GSH、NPT的增加可能來自于蛋白質降解的途徑。作者的研究結果為揭示葉片衰老過程中Cd積累的調控機制提供了依據。在高羊茅蛋白質降解過程中，通過促進PC、GSH、NPT與Cd的結合，可進一步提高高羊茅枯葉提取效率。