中文名稱：PILNCR1-miR399在玉米低磷脅迫下發(fā)揮重要作用

發(fā)表期刊：Plant Physiology

影響因子：5.949

發(fā)表單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作科所李文學(xué)課題組

材料和方法：磷高效玉米CCM454和磷低效玉米31778用250uMPO43-或5uMPO43-進(jìn)行處理達(dá)到磷缺乏或充足條件，處理2天和8天的根和地上部分做鏈特異性建庫

實(shí)驗(yàn)方法：玉米穩(wěn)轉(zhuǎn)、煙草和玉米原生質(zhì)體瞬轉(zhuǎn)、qPCR、NorthernBlot、原位雜交、5，RACE等

摘要：擬南芥中microRNA399（miR399）/PHOSPHATE2（PHO2）途徑介導(dǎo)的缺磷（P）適應(yīng)性響應(yīng)調(diào)控已得到較為充分研究，但玉米中的相關(guān)研究則少之又少。該研究發(fā)現(xiàn)，在磷酸鹽（Pi）缺乏條件下，玉米miR399轉(zhuǎn)錄本被強(qiáng)烈誘導(dǎo)。過表達(dá)MIR399b的轉(zhuǎn)基因玉米在其芽中積累了過量的P，并且具有典型的Pi毒性表型。研究人員用額外的1165bp的5’非翻譯區(qū)重新注釋了ZmPHO2。miR399介導(dǎo)的ZmPHO2轉(zhuǎn)錄后抑制主要出現(xiàn)在磷高效株系中。采用鏈特異性RNA建庫方法鑒定出缺Pi誘導(dǎo)的長鏈非編碼RNA1（PILNCR1）。在本氏煙和玉米葉原生質(zhì)體中瞬時表達(dá)測定結(jié)果表明，PILNCR1抑制ZmmiR399介導(dǎo)的ZmPHO2切割。磷低效株系中PILNCR1的豐度顯著高于磷高效株系，這與ZmmiR399轉(zhuǎn)錄本的豐度一致。該研究結(jié)果表明，PILNCR1和miR399之間的相互作用在玉米耐低磷方面具有重要作用。

研究背景

盡管土壤中總的磷含量很高，但由于無機(jī)磷酸鹽的移動性差、溶解性低，導(dǎo)致土壤中能夠被植物直接吸收利用的有效磷濃度很低，使植物處于一種低磷脅迫的亞健康狀態(tài)。磷的有效性已經(jīng)成為限制作物生產(chǎn)的主要環(huán)境因素之一。植物在長期的進(jìn)化過程中形成了一系列適應(yīng)低磷脅迫的機(jī)制，以充分利用自身特性來提高抗逆能力。不同玉米自交系對低磷脅迫的響應(yīng)不同，解析磷高效和磷低效玉米品種適應(yīng)低磷脅迫分子機(jī)制的差異，有助于篩選和培育磷高效玉米品種。miR399-PHO2調(diào)控通路參與植物適應(yīng)低磷脅迫分子機(jī)制在擬南芥和水稻中研究的比較清楚，而玉米中還沒有報道。

該研究揭示了PILNCR1-miR399互作及miR399-PHO2調(diào)控通路在不同磷利用效率玉米自交系中具有不同的作用方式，這對于培育磷高效玉米品種具有重要意義。

研究結(jié)果

1、Pi缺乏時ZmmiR399上調(diào)

PHO2在擬南芥、水稻和大麥中已經(jīng)被證實(shí)是miR399的靶標(biāo)，但是在玉米中預(yù)測ZmmiR399的靶標(biāo)不包含PHO2和類PHO2基因，于是我們?nèi)フ{(diào)查miR99在玉米中的生物學(xué)功能。首先，我們調(diào)查了在磷充足（250uMPO43-）和缺乏（5uMPO43-）水培溶液中ZmmiR399的響應(yīng)。在磷酸鹽缺乏處理的第八天出現(xiàn)了表型差異，在P缺乏的玉米上表現(xiàn)出典型的P缺乏表型，在老葉上有黃酮類物質(zhì)的積累。

為了測定在P缺乏時ZmmiR399的表達(dá)，我們執(zhí)行了一個隨Pi缺乏處理時間的增長，ZmmiR399在玉米根和地上部分表達(dá)情況的檢測，如圖1A。在Pi脅迫下，ZmmiR399的表達(dá)水平在玉米的根和地上部分都有大幅度的增加，且ZmmiR399的表達(dá)量肯定是和Pi缺乏的時間是相關(guān)的。

圖1：MIR399b過表達(dá)轉(zhuǎn)化玉米在水培下的表型，A，smallRNAnorthernblot顯示在Pi缺乏的玉米根和地上部分的miR399是上調(diào)的；B，水培下的MIR399b過表達(dá)玉米的Pi中毒表型；C，Pi缺乏條件下，野生型和突變體玉米中根和地上部分的P濃度；D，Pi缺乏條件下，野生型和突變體的根和地上部分的干重。

2、ZmMIR399過表達(dá)的轉(zhuǎn)化玉米植株在地上部分的P積累

為了進(jìn)一步調(diào)查ZmMIR399的功能，我們構(gòu)建了ZmMIR399b過表達(dá)的轉(zhuǎn)化玉米植株，利用農(nóng)桿菌作為中介將ZmMIR399b的前提序列導(dǎo)入玉米自交系ZZCO1未成熟的胚胎中，根據(jù)ZmMIR399b的表達(dá)情況，選出了兩個獨(dú)立的轉(zhuǎn)化時間，圖1B。在水培條件下評估ZmMIR399b過表達(dá)轉(zhuǎn)化玉米對低Pi的應(yīng)答。由于ZmPHTs是ZmMIR399的潛在靶標(biāo)，且PHT與PHO2不是同系物，所以在擬南芥和水稻中的miR399過表達(dá)植株中出現(xiàn)的P中毒表型不會出現(xiàn)在玉米的轉(zhuǎn)化株中，但是在Pi缺乏條件下，ZmMIR399b過表達(dá)的玉米植株出現(xiàn)了典型的P中毒表型，在老葉的頂端和邊緣有萎黃或壞死，見1B。在Pi缺乏條件下，ZmMIR399b過表達(dá)的玉米老葉的P濃度是野生型的2倍，見圖1C。而在根中，野生型的總P濃度比轉(zhuǎn)化玉米的濃度高16-25%，見圖1C。相比之下，在P缺乏條件下野生型和轉(zhuǎn)化株根和地上部分的干重是相似的。

3、ZmPHO2是ZmmiR399的靶標(biāo)

ZmMIR399b過表達(dá)的玉米在P缺乏條件下的p中毒的表型在擬南芥的pho2突變體的表型得到了重現(xiàn)，所以這引發(fā)我們?nèi)パ芯縕mMIR399b過表達(dá)的玉米中的ZmPHO2的轉(zhuǎn)錄水平，即使ZmPHO2不是ZmmiR3999的預(yù)測靶標(biāo)。在玉米中，GRMZM2G381709和GRMZM2G464572與擬南芥中的PHO2是同源的。在MaizeGDB上，我們發(fā)現(xiàn)GRMZM2G381709和GRMZM2G464572的cDNA序列是一致的，因此我們設(shè)計(jì)了引物，在ZmMIR399b的過表達(dá)轉(zhuǎn)化玉米中去檢測GRMZM2G381709和GRMZM2G464572的轉(zhuǎn)錄本。

如圖2A，ZmMIR399b過表達(dá)顯著降低了玉米中GRMZM2G381709/GRMZM2G464572的表達(dá)水平，為了進(jìn)一步檢測GRMZM2G381709/GRMZM2G464572與ZmmiR399的的關(guān)系，我們首先證實(shí)了GRMZM2G381709和GRMZM2G464572在玉米中的注釋，我們使用5，RACE，克隆到一個1276bp的一個片段。通過MaizeGDB，我們在原來預(yù)測到的GRMZM2G381709的5，UTR加上一個1165bp的一個片段。進(jìn)一步的分析顯示，新克隆的GRMZM2G381709的5，UTR有6個ZmmiR399的切割位點(diǎn)。感興趣的是，我們對ZmPHO2的5，RACE產(chǎn)物的30個克隆進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)每一個片段都屬于GRMZM2G381709，這說明在玉米中有很少或沒有GRMZM2G464572的轉(zhuǎn)錄本。GRMZM2G381709被叫做ZmPHO2。

我們接下來用兩個miR399結(jié)構(gòu)（ZmMIR399b和ZmMIR399bmut將6個突變引入到ZmMIR399b的成熟序列中）在煙草中做瞬時轉(zhuǎn)化。如圖2B，當(dāng)與ZmMIR399b共表達(dá)時，ZmPHO2轉(zhuǎn)錄本顯著增加，但是與ZmMIR399bmut共表達(dá)時卻不受影響（見圖2C）。另外，我們使用缺pi脅迫六天的玉米苗子的RNA，通過5，RACE檢測到6個ZmPHO2的預(yù)測靶標(biāo)中的4個，見圖2D。這些結(jié)果顯示，在玉米中ZmPHO2是ZmmiR399的靶標(biāo)，miR399-PHO2調(diào)控模塊在玉米中是保守的，和在擬南芥和水稻中一樣。

圖2：ZmPHO2被miR399轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。A，qPCR檢測過表達(dá)轉(zhuǎn)化株的ZmPHO2轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)；B、C，通過northernblot檢測MIR399b/MIR399bmut和ZmPHO2在煙草中的表達(dá)；D，通過5，RACE檢測ZmPHO2的切割位點(diǎn)

4、在磷高效和磷低效玉米中檢測ZmmiR399和ZmPHO2的表達(dá)水平

之前根據(jù)磷高效株系CCM454和磷低效株系31778在pi缺乏條件下的RNA-seq轉(zhuǎn)錄組分析，我們鑒定到了差異表達(dá)基因有22個miRNA屬于10個miRNA家族，包括miRNA399家族。在本研究中，我們執(zhí)行了一個時序?qū)嶒?yàn)來檢測在磷高效和磷低效株系中的ZmmiR399的表達(dá)水平。如圖3A，在pi缺乏條件下的磷高效株系CCM454和磷低效株系31778中ZmmiR399的表達(dá)量都是上調(diào)的。意外地是，如圖3A，miR399誘導(dǎo)的ZmPHO2后轉(zhuǎn)錄抑制僅在CCM454中檢測到。與此相反，在31778株系中，在pi缺乏下，ZmmiR399的表達(dá)雖然是增加的，但是ZmPHO2的轉(zhuǎn)錄本也是上調(diào)的。

為了驗(yàn)證這些結(jié)果，我們還檢測了另外三株磷低效株系（FR19、1538、J1419）和三株磷高效株系（X114、HAI9-21、Q1261）的ZmmiR399的表達(dá)，這些株系是通過560個株系中鑒定出來的。如圖3B，其結(jié)果與在31778和CCM454中是一致的，除了Q1261以外。在磷缺乏處理7天后，ZmPHO2轉(zhuǎn)錄本在磷高效株系中是下調(diào)的，在磷低效株系中是上調(diào)的。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證在低磷脅迫的玉米中miRNA/PHO2之間的關(guān)系，用磷低效株Qi205和磷高效株CCM454進(jìn)行雜交，構(gòu)建分離群體。從F2:3家系中隨機(jī)選擇出來100個株系去確定水培條件下的低磷脅迫情況。選擇出10個最耐和10個最感的株系，再從剩余的80個株系中選出來10個株系作為對照。在低磷脅迫下，這些株系的ZmmiR399是上調(diào)的。在磷高效株系中，觀察到通過ZmmiR399誘導(dǎo)的ZmPHO2是下調(diào)的。這些結(jié)果表明，在玉米中miR399誘導(dǎo)的ZmOHO2后轉(zhuǎn)錄抑制增加了對磷缺乏的耐性。

圖3：在磷高效和磷低效玉米株系中miR399的表達(dá)分析。A,在玉米自交系31778和CCM454中miR399和ZmPHO2轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)；B，在其他玉米株系中miR399和ZmPHO2轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)

5、與ZmmiR399相關(guān)的lncRNA的鑒定

為了闡明ZmmiR399誘導(dǎo)的ZmPHO2的調(diào)控在磷高效和磷低效玉米植株中的差異，我們首先在不同玉米植株中檢查ZmmiR399與ZmPHO2結(jié)合位點(diǎn)的序列。除了Q1261以外，在磷高效株和磷低效株中ZmmiR399與ZmPHO2結(jié)合位點(diǎn)的序列是一致的。這表明在玉米中其他調(diào)控機(jī)制影響miR399誘導(dǎo)的ZmPHO2的表達(dá)。一種可能就是lncRNA。為了證實(shí)這種可能，我們利用低P脅迫2天和8天的林高效玉米CCM454和磷低效玉米31778的根和地上部分，構(gòu)建鏈特異性文庫。使用HISAT2和StringTie，一共從組裝的轉(zhuǎn)錄組中鑒定到178771個定向轉(zhuǎn)錄本，然后用FEELnc和alignment-free軟件進(jìn)行評估，最終72429個轉(zhuǎn)錄本被鑒定出來，包含46972個lincRNAs，2511個lncNATs和1217個incRNAs。與之前的研究相一致，被鑒定出來的大多數(shù)（79%）lncRNAs由單個外顯子組成，如圖4A。lncRNA基因是相對短的，平均長度是788bp，僅有18%的lncRNA基因的長度是超過1kb的，見圖4B。為了進(jìn)一步證實(shí)預(yù)測到的lncRNA基因，我們隨機(jī)選擇了19個lincRNAs在低磷脅迫7天的玉米RNA進(jìn)行克隆。隨機(jī)選出的19個lincRNA中的16個通過RT-PCR被證實(shí)，見圖4C。這些lncRNA通過測序被證實(shí)，這些結(jié)果也說明了我們的結(jié)果是可信的。

圖4：玉米lncRNAs的鑒定。A，每個lncRNA轉(zhuǎn)錄本的外顯子分布；B，lncRNA的外顯子長度密度分布；C，RT-PCR證實(shí)隨機(jī)選擇的lncRNA

6、PILNCR1抑制ZmmiR399誘導(dǎo)ZmPHO2的切割

如圖5A，由于lncRNA819包含ZmmiRNAd的一段互補(bǔ)區(qū)域，所以它吸引了我們的注意力。使用3，和5，RACE，一個不包含內(nèi)含子的677bp的cDNA的序列被克隆出來。如圖5B，在磷高效玉米CCM454和磷低效玉米31778植株中，lncRNA819被磷缺乏誘導(dǎo)顯著表達(dá)，因此我們將lncRNA819叫做PILNCR1。

在之前的西紅柿和擬南芥的報道中，在番茄中有TPSI家族中的好幾個基因包含有miR399的互補(bǔ)區(qū)域。在這個家族中較大的成員是IPS1和其同源基因At4在擬南芥中影響miR399的切割。不像在擬南芥中，IPS1和At4編碼一個保守肽，PILNCR1在玉米中缺乏編碼肽的潛能。另外，在玉米中有3個候選ZmIPS1/ZmAt4。由于MaizeGDB的注釋有低置信度，GRMZM2G086179不做進(jìn)一步的考慮。GRMZM5G843352和GRMZM2G436295從DNA相反鏈的同一位置轉(zhuǎn)錄出來。做cDNA序列比對分析之后，發(fā)現(xiàn)PILNCR1與GRMZM5G843352和GRMZM2G436295沒有同源性。進(jìn)一步的共線性分析顯示，PILNCR1和AtIPS1/AtAT4s不在同一條染色體上。以上結(jié)果總結(jié)顯示，PILNCR1和AtIPS1/AtAT4s之間存在特征性差異。然后我們在本氏煙和玉米葉片的原生質(zhì)體中執(zhí)行瞬時表達(dá)去驗(yàn)證PILNCR1是否能影響植物中miR399的切割。

我們測試了兩個PILNCR1結(jié)構(gòu)：一個全長的PILNCR1和一個刪掉了miR399的互補(bǔ)區(qū)域的結(jié)構(gòu)（PILNCR1del）與本氏煙共表達(dá)兩天后，提取RNA，通過RT-qPCR分析ZmPHO2的表達(dá)。見圖5C，當(dāng)ZmmiR399b和PILNCR1共表達(dá)時，ZmPHO2的表達(dá)被ZmmiR399b顯著降低。然而，當(dāng)ZmmiR399b與PILNCR1del共表達(dá)時，ZmPHO2的表達(dá)水平被顯著降低，說明PILNCR1的互補(bǔ)區(qū)域?qū)mmiR399的調(diào)控是非常重要的。圖5D，當(dāng)ZmmiR399b與玉米葉片的原生質(zhì)體共表達(dá)時，同樣的結(jié)果也被獲得了。這些結(jié)果表明PILNCR1能有效較少ZmmiR399b的效應(yīng)。

圖5：PILNCR1對ZmmiR399誘導(dǎo)的ZmPHO2切割的影響。A，玉米中PILNCR1與miR399b之間的互補(bǔ)區(qū)域示意圖；B，RT-qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證在p缺乏條件下的磷高效玉米CCN454和磷低效玉米31778中PILNCR1的表達(dá)；C，本氏煙中miR399、ZmPHO2、PILNCR1和PILNCR1del不同組合的共表達(dá)；D，玉米葉片原生質(zhì)體中miR399和PILNCR1組合的共表達(dá)

7、ZmmiR399b和PILNCR1的表達(dá)模式

為了進(jìn)一步揭示ZmmiR399b和PILNCR1之間可能的關(guān)系，我們通過原位雜交驗(yàn)證ZmmiR399b和PILNCR1的表達(dá)模式。由于在磷充足條件下，ZmmiR399b和PILNCR1在玉米中的豐度比較低，于是去在pi缺乏條件下的第7天的玉米根和地上部分來驗(yàn)證ZmmiR399b和PILNCR1表達(dá)模式。ZmmiR399b和PILNCR1在玉米的根和地上部分均能被檢測到，尤其是在維管束里，見圖6A-B。這些結(jié)果顯示ZmmiR399b和PILNCR1的空間定位至少有部分是重合的。

圖6：ZmmiR399b和PILNCR1在玉米中的累積模式

8、PILNCR1與玉米低磷脅迫是相關(guān)的

為了進(jìn)一步調(diào)查玉米低磷脅迫時PILNCR1的功能，我們通過RT-qPCR，檢測在磷高效玉米（CCM454、X114、HAI9-21、Q1261）和磷低效玉米（31778、FR19/1538、J1419）中PILNCR1的表達(dá)量。在pi缺乏條件下，在磷高效株和磷低效株中PILNCR1的表達(dá)量都是低的，見圖7。然而，當(dāng)玉米收到低P脅迫7天后，磷低效玉米株中的PILNCR1的表達(dá)量是磷高效株中的6倍。

圖7：在磷高效和磷低效玉米葉片中PILNCR1的表達(dá)

總結(jié)

本研究發(fā)現(xiàn)在玉米中miR399特異性受低磷脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)；同時在miR399過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因玉米植株中磷由根部向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)增多，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株的成熟葉片邊緣出現(xiàn)干枯壞死的磷中毒表型，表明miR399對于玉米體內(nèi)磷穩(wěn)態(tài)平衡具有重要作用。研究人員通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)玉米中PHO2是miR399的靶基因，并對其進(jìn)行重新注釋，表明miR399-PHO2調(diào)控通路在玉米、擬南芥、水稻中是保守的。研究還發(fā)現(xiàn)玉米中miR399介導(dǎo)的PHO2轉(zhuǎn)錄后水平的切割主要出現(xiàn)在磷高效玉米自交系中。同時研究人員發(fā)現(xiàn)了一種長鏈非編碼RNA——PILNCR1可與PHO2競爭性結(jié)合miR399，削弱了miR399對靶基因PHO2的剪切；并且在低磷脅迫條件下，磷低效玉米自交系中PILNCR1和miR399的表達(dá)豐度顯著高于磷高效玉米自交系，高表達(dá)量的PILNCR1會結(jié)合較多的miR399，從而導(dǎo)致靶基因PHO2上調(diào)表達(dá)，表明PILNCR1和miR399的表達(dá)量與玉米耐受低磷脅迫的能力相關(guān)。