研究背景
膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)是成人最常見的原發(fā)性腦腫瘤，由于不可避免地會(huì)出現(xiàn)浸潤(rùn)細(xì)胞超出切除范圍，所以預(yù)后仍不理想。此外，腫瘤邊緣區(qū)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的化療效果較差，并與腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)?？紤]到浸潤(rùn)邊緣腫瘤細(xì)胞相比于中心區(qū)細(xì)胞具有獨(dú)特的微環(huán)境和轉(zhuǎn)錄特征，這兩種細(xì)胞群可能受不同的分子通路調(diào)控。
表觀遺傳學(xué)對(duì)于正常干細(xì)胞發(fā)育和分化過(guò)程中的可塑性、維持異常癌癥干細(xì)胞狀態(tài)至關(guān)重要。在GBM中，染色質(zhì)重構(gòu)支持膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(GSC)發(fā)育過(guò)程的重現(xiàn)，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。研究已發(fā)現(xiàn)了在培養(yǎng)的GSC或患者來(lái)源的異種移植老鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型中與遷移和浸潤(rùn)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子（TF），如ZEB1、STAT324等。然而，由于浸潤(rùn)性腫瘤細(xì)胞在其微環(huán)境中對(duì)運(yùn)動(dòng)性、黏附性、缺氧、代謝和免疫反應(yīng)的復(fù)雜適應(yīng)，這些TF在多大程度上調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞遷移一直較難分辨。對(duì)直接從腫瘤灶分離的人類GSC群的TF進(jìn)行分析，可以發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)細(xì)胞和混合正常腦實(shí)質(zhì)的中沒有的調(diào)控遷移的內(nèi)在調(diào)節(jié)因子。
在此，作者從人GBM和生發(fā)層(GM)組織中直接分離出GSC和神經(jīng)干細(xì)胞/祖細(xì)胞(NSPC)，基于ATAC-seq研究在相似的發(fā)育背景下腫瘤發(fā)生的內(nèi)在轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及其調(diào)控機(jī)制。
研究方法
- ATAC-seq
通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選術(shù)（FACS）從GM和GBM組織中分離的細(xì)胞GSC（EGF+/-）、NSPC（EGF+/-），分別進(jìn)行ATAC-seq。
- 功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
CRISPR-Cas9基因敲除與過(guò)表達(dá)（TEAD1、TEAD4、EGFR等）；RNA-seq；體外–細(xì)胞增殖與遷移實(shí)驗(yàn)；體內(nèi)–異種移植實(shí)驗(yàn)；染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)等。
研究結(jié)果
GSC的全基因組染色質(zhì)可及性特征
E – GBM在體外缺乏干細(xì)胞特性，在體內(nèi)缺乏腫瘤發(fā)生機(jī)制，為了明確評(píng)估GSC中染色質(zhì)可及性在發(fā)育方面的作用，將E+GSC和E+NSPC干細(xì)胞中富集peak與E- GBM相比較，發(fā)現(xiàn)了5020個(gè)差異peak，這些peak關(guān)聯(lián)基因進(jìn)行功能注釋與富集分析表明這些基因與干細(xì)胞維持和增殖的生物學(xué)過(guò)程相關(guān)。作者對(duì)E+GSC與所有其他細(xì)胞群(NSPC與E-GBM)進(jìn)行了差異可及性分析，以鑒定腫瘤干細(xì)胞表型特有的調(diào)控因子，發(fā)現(xiàn)了在腫瘤GSC中特異性富集的10509個(gè)peak，對(duì)應(yīng)4015個(gè)蛋白編碼基因，它們與細(xì)胞遷移、運(yùn)動(dòng)和ECM過(guò)程具有顯著的相關(guān)性。在比較E+GSC和NSPC轉(zhuǎn)錄組時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類似的功能基因集關(guān)聯(lián)。
基于ATAC-seq鑒定GSC中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子
通過(guò)ATAC-seq分析染色質(zhì)的可及性，不僅可以識(shí)別轉(zhuǎn)錄的調(diào)控區(qū)域，還可以推斷出其中的TF活性。在此，作者鑒定了27個(gè)GSC腫瘤特異性的TF motif，26個(gè)在E+GSC和E+NSPC中共有的發(fā)育相關(guān)TF motif。其中，TEAD1/4是具有很高活性的TF（ motif是GSC特有peak中顯著富集，且基因表達(dá)水平高），其它候選TF包括ATF3、RFX1、FOXA1等。而E+GSC和E+NSPC中共有的發(fā)育相關(guān)TF包括SOX1、IRF3、NFIA等。然后,作者利用以前的類似的E+/E-GBM的RNA-seq數(shù)據(jù)，考慮到腫瘤特異性TF的基因表達(dá)水平，其中只有TEAD1在E+GSC中差異過(guò)表達(dá)。
此外，作者分析了所有TEAD家族成員(1-4)在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)RNA-seq數(shù)據(jù)中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)TEAD1是150個(gè)GBM樣本中表達(dá)最高的TEAD家族成員，且在蛋白水平上，TEAD1在PDX膠質(zhì)瘤中表達(dá)。因此，TEAD1是GBM腫瘤中表達(dá)最高、表達(dá)最廣泛的TEAD家族成員。
TEAD1的功能性作用
在體外實(shí)驗(yàn)中，利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)敲除TEAD1/4，發(fā)現(xiàn)KO腫瘤細(xì)胞系的增殖與遷移受到抑制，而過(guò)表達(dá)TEAD1/4后則可增強(qiáng)其調(diào)控作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞系的增殖與遷移。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，選擇體外抗遷移效果最強(qiáng)的TEAD1KO細(xì)胞系進(jìn)行異種移植，發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤(rùn)的面積和體積均顯著降低?？傊琓EAD1是在GBM遷移中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。
體外功能驗(yàn)證
體內(nèi)功能驗(yàn)證
TEAD1調(diào)控的靶基因篩選
GSC中TEAD1可接近區(qū)域peak（ATAC-seq）和基因表達(dá)水平（RNA-seq）的一致性分析，結(jié)合GBM中TEAD1與基因共表達(dá)（TCGA中的GBM RNA-seq數(shù)據(jù)）分析，發(fā)現(xiàn)TEAD1的靶基因包括EGFR、AQP4、CDH4、TNC等多個(gè)候選靶基因。
作者利用不同亞型人GBM腫瘤樣本，通過(guò)ChIP-PCR對(duì)TEAD1的候選靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。進(jìn)一步結(jié)合TEAD1KO相比于對(duì)照的異種移植樣本中靶基因表達(dá)水平，EGFR、AQP4、CDH4在TEAD1KO樣本中表達(dá)下調(diào)，因此，TEAD1可能是通過(guò)結(jié)合靶基因EGFR、AQP4、CDH4調(diào)控其表達(dá)進(jìn)而參與GBM遷移。
TEAD1調(diào)控靶基因參與遷移的機(jī)制
TEAD1KO異種移植樣本中EGFR的表達(dá)水平低于對(duì)照樣本，且TEAD1KO細(xì)胞系中EGFR表達(dá)相比于正常對(duì)照細(xì)胞系顯著下調(diào)，TEAD1過(guò)表達(dá)后EGFR表達(dá)有回升。對(duì)EGFR下游信號(hào)元件的表達(dá)水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，pERK在TEAD1KO細(xì)胞中下調(diào)，而pAKT則不同。TEAD1KO細(xì)胞經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)后，EGFR表達(dá)恢復(fù)，而遷移仍受影響。因此，TEAD1直接且短暫地調(diào)控EGFR。
在對(duì)照和TEAD1KO細(xì)胞中過(guò)表達(dá)AQP4后，細(xì)胞的遷移能力提高了~ 50%，說(shuō)明AQP4在GBM遷移中發(fā)揮了一定作用。且過(guò)表達(dá)TEAD1后不僅促進(jìn)細(xì)胞的遷移，同時(shí)也上調(diào)了AQP4的內(nèi)源性表達(dá)。因此，TEAD1和其下游靶基因AQP4的表達(dá)在促進(jìn)原發(fā)性GBM細(xì)胞的遷移中存在直接的機(jī)制聯(lián)系。
小結(jié)
作者通過(guò)ATAC-seq繪制了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞（GSC）和神經(jīng)干細(xì)胞（NSPC）的全基因組染色質(zhì)開放區(qū)域圖譜，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)了在腫瘤細(xì)胞遷移中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子TEAD1，并通過(guò)細(xì)胞和異種移植模型水平上的TEAD1的敲除與過(guò)表達(dá)的體內(nèi)外功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了TEAD1促進(jìn)遷移的功能性作用。
作者通過(guò)ATAC-seq和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)篩選出來(lái)TEAD1的候選靶基因，并進(jìn)一步利用ChIP-PCR，驗(yàn)證了與TEAD1結(jié)合的靶基因–AQP4、EGFR和CDH4。TEAD1敲除使AQP4下調(diào)，TEAD1過(guò)表達(dá)可恢復(fù)AQP4的表達(dá)，而TEAD1和AQP4過(guò)表達(dá)均可修復(fù)TEAD1KO細(xì)胞的遷移缺陷，說(shuō)明TEAD1作用于靶基因AQP4，調(diào)控其表達(dá)，進(jìn)而參與GBM遷移的直接調(diào)控機(jī)制。
【文獻(xiàn)】
Tome-Garcia J, Erfani P, Nudelman G, et al. Analysis of chromatin accessibility uncovers TEAD1 as a regulator of migration in human glioblastoma[J]. Nature Communications, 2018, 9(1).
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