實驗結(jié)果

開花誘導(dǎo)在蘋果樹生命周期中發(fā)揮非常重要的作用，但是年輕的蘋果樹往往容易產(chǎn)生低質(zhì)量的數(shù)量少的花芽。嫩枝彎曲可以促進(jìn)產(chǎn)生較多的花芽，因此嫩枝彎曲成為蘋果樹一個非常重要的栽培性狀。樹嫩枝彎曲會產(chǎn)生一種新的長距離信號，從而改變樹的生長和發(fā)育。但是，響應(yīng)嫩枝彎曲發(fā)生的花芽生長和開花誘導(dǎo)的分子調(diào)控機(jī)制并不清楚，尤其是miRNA是否在其調(diào)控中發(fā)揮作用以及具體的機(jī)制如何。本研究關(guān)注在花芽發(fā)育、開花誘導(dǎo)和發(fā)育、響應(yīng)嫩枝彎曲過程中miRNA的潛在作用。

研究目的

解析蘋果樹響應(yīng)嫩枝彎曲時，植物激素和miRNA協(xié)同調(diào)控花芽生長和開花誘導(dǎo)的分子機(jī)制，有助于解決年輕蘋果樹低質(zhì)量花芽的問題。

材料方法

1.實驗材料：
生長六年大小的富士蘋果樹，分兩組進(jìn)行嫩枝彎曲（110度）、對照處理（垂直嫩枝），分別在開花誘導(dǎo)的初期（early stage，ES）、中期（Middle stage，MS）和晚期（Later stage，LS）取花芽，分別提取RNA進(jìn)行小RNA測序，6個花芽組織RNA混樣進(jìn)行降解組測序。
2.測序方法：
小RNA seq，Biomarker Illunima Hiseq 2000 platform

技術(shù)路線

實驗結(jié)果

1. 富士蘋果樹在開花誘導(dǎo)時期響應(yīng)嫩枝彎曲后的花芽生長
首先，研究富士蘋果樹在開花誘導(dǎo)時期，嫩枝彎曲處理后花芽生長情況。無論是對照還是嫩枝彎曲處理，從發(fā)育早期（ES）到晚期（LS），花芽的長度、寬度、干重都增加了。但是，嫩枝彎曲明顯增加了花芽的大小。此外，通過檢測花芽生長速率發(fā)現(xiàn)，花芽大小變化主要發(fā)生在花芽誘導(dǎo)的早期，即ES到MS時期；而且，在嫩枝彎曲處理下花芽生長速率明顯增加了。實驗結(jié)果還顯示，嫩枝處理組比對照組的開花速率明顯增大了。

2. 開花誘導(dǎo)時期花芽中激素含量的變化。
分別在開花誘導(dǎo)的三個時間點（ES, MS, LS），對嫩枝彎曲處理組和對照組的花芽中激素（生長素，AUX；脫落酸，ABA；細(xì)胞分裂素，CK；赤霉素，GA）含量進(jìn)行檢測。分析了在嫩枝彎曲組合對照組，開花誘導(dǎo)過程中各種激素含量的變化。

3. 小RNA和降解組文庫構(gòu)建和測序。
為了研究嫩枝處理和對照組在ES、MS和LS時期小RNA的情況，構(gòu)建了6個miRNA文庫（CES, CMS, CLS, BES, BMS, BLS）并用Illunima Hiseq 2000進(jìn)行了測序?？偣搏@得了14 095 388, 14 106 904, 15 242 433, 13 259 311, 15 969 504 和13 523 103 raw reads。此外，對這六個組織提取的總RNA構(gòu)建了降解組文庫并進(jìn)行了測序，總共獲得了30 762 927 (93.08%) clean reads。分別對文庫進(jìn)行了插入片段大小分布的評估，對sRNA的長度進(jìn)行了統(tǒng)計分析。

4. 已知miRNA的鑒定和表達(dá)模式分析。
為了鑒定蘋果中已知的miRNA，用BLASTN將這六個花芽的sRNAs比對到miRBase 18.0 和植物miRNA數(shù)據(jù)庫中?？偣搏@得了屬于41個miRNA家族的195個已知的miRNA。然后對已知miRNA的表達(dá)量進(jìn)行了分析。

Fig1. 差異表達(dá)已知miRNA維恩圖

對同一處理不同發(fā)育時期樣品間（CMS vs CES, CLS vs CMS, CLS vs CES, BMS vs BES, BLS vs BMS and BLS vs BES）篩選了差異表達(dá)miRNA并繪制了維恩圖。結(jié)果顯示，其中42個miRNA下調(diào)表達(dá)，20個miRNA上調(diào)表達(dá)。對不同處理相同發(fā)育時期樣品間（BES vs CES, BMS vs CMS and BLS vs CLS）篩選到124個差異表達(dá)miRNA，相對對照組，嫩枝彎曲處理組中68個下調(diào)表達(dá)，27個上調(diào)表達(dá)。

5. 新miRNA的鑒定和表達(dá)模式分析。
用栽培種蘋果（Malus domestica Borkh）作為參考基因組來預(yù)測潛在的新miRNA，共鑒定到137個新miRNA。對同一處理不同發(fā)育時期樣品間（CMS vs CES, CLS vs CMS, CLS vs CES, BMS vs BES, BLS vs BMS and BLS vs BES）新miRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析并繪制了維恩圖。結(jié)果顯示，其中34個新miRNA隨著發(fā)育時期上調(diào)表達(dá)，24個新miRNA在嫩枝彎曲處理組表達(dá)高于對照組，23個新miRNA在對照組表達(dá)明顯高于嫩枝彎曲處理組。

對嫩枝彎曲處理組和對照組間的31個差異表達(dá)新miRNA進(jìn)行表達(dá)層次聚類分析。結(jié)果顯示，根據(jù)表達(dá)模式可分為5個亞簇。其中Cluster 1中的6個新miRNA在嫩枝彎曲組表達(dá)量均高于對照組。Cluster 5中的新miRNA表達(dá)模式則與Cluster 1中相反。其他三簇中的19個新miRNA，無論在對照組還是嫩枝彎曲處理組，展現(xiàn)出較低的表達(dá)水平。

Fig2. 差異表達(dá)新miRNA聚類熱圖

6. 已知和新miRNA的靶基因分析。
為了研究鑒定的已知和新miRNA參與的生物學(xué)過程，以及分析嫩枝彎曲調(diào)控開花誘導(dǎo)的分子機(jī)制，通過降解組來鑒定miRNA的靶基因。上文的分析顯示，在對照組和嫩枝彎曲組之間篩選到了41個家族195個已知miRNA。對這些已知miRNA以及它們目標(biāo)切割位點的具體分布信息進(jìn)行了分析。同時，鑒定了31個差異表達(dá)新miRNA的40個靶標(biāo)。

新miRNA調(diào)控的靶基因包括一些轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控蛋白。如，新m1736-3p的靶基因為編碼一個myb-like的HTH轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白（DUO1）。一些新miRNA調(diào)控的靶基因與植物激素相關(guān)，如新m1791-5p調(diào)控的靶基因為參與CK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的細(xì)胞分裂素響應(yīng)因子CRF4。此外，一些新miRNA的靶基因參與糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝，如新miR1316-5p調(diào)控靶基因BGAL3。

7. 定量RT-PCR鑒定與AUC、ABA、控制開花相關(guān)的差異表達(dá)miRNA和靶基因
為了驗證miRNA測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，以及分析在不同發(fā)育時期（ES-MS-LS）miRNA和靶基因的表達(dá)水平，我們檢測了在響應(yīng)嫩枝彎曲時與IAA、ABA、控制開花相關(guān)的miRNA和靶基因的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，與IAA、ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的miRNA和靶基因可能參與調(diào)控響應(yīng)嫩枝彎曲時蘋果花芽的形成。

創(chuàng)新點

1.蘋果樹嫩枝彎曲可以促進(jìn)產(chǎn)生較多的花芽，嫩枝彎曲是蘋果樹一個非常重要的栽培性狀，研究解析蘋果樹響應(yīng)嫩枝彎曲的分子機(jī)制，有助于解決年輕蘋果樹低質(zhì)量花芽的問題。
2.結(jié)合降解組的數(shù)據(jù)來分析鑒定miRNA的靶基因，更具有說服力。
3.分析了嫩枝彎曲誘導(dǎo)開花過程中激素含量的變化，并集合miRNA測序數(shù)據(jù)針對性地分析了激素相關(guān)基因的調(diào)控作用，深入解析了分子機(jī)制。
4.大量qRT-PCR實驗對miRNA和降解組測序數(shù)據(jù)的驗證。

參考文獻(xiàn)

[1] Libo Xing, Dong Zhang, Caiping Zhao, Youmei Li, Juanjuan Ma, Na An and Mingyu Han, (2015) Shoot bending promotes flower bud formation by miRNA-mediated regulation in apple (Malus domestica Borkh.) Plant Biotechnology Journal, pp. 749–770.