研究背景
膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)是成人最常見的原發(fā)性腦腫瘤，由于不可避免地會出現(xiàn)浸潤細胞超出切除范圍，所以預(yù)后仍不理想。此外，腫瘤邊緣區(qū)的膠質(zhì)瘤細胞的化療效果較差，并與腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)。考慮到浸潤邊緣腫瘤細胞相比于中心區(qū)細胞具有獨特的微環(huán)境和轉(zhuǎn)錄特征，這兩種細胞群可能受不同的分子通路調(diào)控。
表觀遺傳學(xué)對于正常干細胞發(fā)育和分化過程中的可塑性、維持異常癌癥干細胞狀態(tài)至關(guān)重要。在GBM中，染色質(zhì)重構(gòu)支持膠質(zhì)瘤干細胞(GSC)發(fā)育過程的重現(xiàn)，促進腫瘤生長。研究已發(fā)現(xiàn)了在培養(yǎng)的GSC或患者來源的異種移植老鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型中與遷移和浸潤相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子（TF），如ZEB1、STAT324等。然而，由于浸潤性腫瘤細胞在其微環(huán)境中對運動性、黏附性、缺氧、代謝和免疫反應(yīng)的復(fù)雜適應(yīng)，這些TF在多大程度上調(diào)節(jié)腫瘤細胞遷移一直較難分辨。對直接從腫瘤灶分離的人類GSC群的TF進行分析，可以發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)細胞和混合正常腦實質(zhì)的中沒有的調(diào)控遷移的內(nèi)在調(diào)節(jié)因子。
在此，作者從人GBM和生發(fā)層(GM)組織中直接分離出GSC和神經(jīng)干細胞/祖細胞(NSPC)，基于ATAC-seq研究在相似的發(fā)育背景下腫瘤發(fā)生的內(nèi)在轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及其調(diào)控機制。
研究方法
- ATAC-seq
通過熒光激活細胞分選術(shù)（FACS）從GM和GBM組織中分離的細胞GSC（EGF+/-）、NSPC（EGF+/-），分別進行ATAC-seq。
- 功能驗證實驗
CRISPR-Cas9基因敲除與過表達（TEAD1、TEAD4、EGFR等）；RNA-seq；體外–細胞增殖與遷移實驗；體內(nèi)–異種移植實驗；染色質(zhì)免疫沉淀實驗等。
研究結(jié)果
GSC的全基因組染色質(zhì)可及性特征
E – GBM在體外缺乏干細胞特性，在體內(nèi)缺乏腫瘤發(fā)生機制，為了明確評估GSC中染色質(zhì)可及性在發(fā)育方面的作用，將E+GSC和E+NSPC干細胞中富集peak與E- GBM相比較，發(fā)現(xiàn)了5020個差異peak，這些peak關(guān)聯(lián)基因進行功能注釋與富集分析表明這些基因與干細胞維持和增殖的生物學(xué)過程相關(guān)。作者對E+GSC與所有其他細胞群(NSPC與E-GBM)進行了差異可及性分析，以鑒定腫瘤干細胞表型特有的調(diào)控因子，發(fā)現(xiàn)了在腫瘤GSC中特異性富集的10509個peak，對應(yīng)4015個蛋白編碼基因，它們與細胞遷移、運動和ECM過程具有顯著的相關(guān)性。在比較E+GSC和NSPC轉(zhuǎn)錄組時也發(fā)現(xiàn)了類似的功能基因集關(guān)聯(lián)。
基于ATAC-seq鑒定GSC中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子
通過ATAC-seq分析染色質(zhì)的可及性，不僅可以識別轉(zhuǎn)錄的調(diào)控區(qū)域，還可以推斷出其中的TF活性。在此，作者鑒定了27個GSC腫瘤特異性的TF motif，26個在E+GSC和E+NSPC中共有的發(fā)育相關(guān)TF motif。其中，TEAD1/4是具有很高活性的TF（ motif是GSC特有peak中顯著富集，且基因表達水平高），其它候選TF包括ATF3、RFX1、FOXA1等。而E+GSC和E+NSPC中共有的發(fā)育相關(guān)TF包括SOX1、IRF3、NFIA等。然后,作者利用以前的類似的E+/E-GBM的RNA-seq數(shù)據(jù)，考慮到腫瘤特異性TF的基因表達水平，其中只有TEAD1在E+GSC中差異過表達。
此外，作者分析了所有TEAD家族成員(1-4)在TCGA數(shù)據(jù)庫RNA-seq數(shù)據(jù)中的表達水平，發(fā)現(xiàn)TEAD1是150個GBM樣本中表達最高的TEAD家族成員，且在蛋白水平上，TEAD1在PDX膠質(zhì)瘤中表達。因此，TEAD1是GBM腫瘤中表達最高、表達最廣泛的TEAD家族成員。
TEAD1的功能性作用
在體外實驗中，利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)敲除TEAD1/4，發(fā)現(xiàn)KO腫瘤細胞系的增殖與遷移受到抑制，而過表達TEAD1/4后則可增強其調(diào)控作用，促進腫瘤細胞系的增殖與遷移。在體內(nèi)實驗中，選擇體外抗遷移效果最強的TEAD1KO細胞系進行異種移植，發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤的面積和體積均顯著降低?？傊琓EAD1是在GBM遷移中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。
體外功能驗證
體內(nèi)功能驗證
TEAD1調(diào)控的靶基因篩選
GSC中TEAD1可接近區(qū)域peak（ATAC-seq）和基因表達水平（RNA-seq）的一致性分析，結(jié)合GBM中TEAD1與基因共表達（TCGA中的GBM RNA-seq數(shù)據(jù)）分析，發(fā)現(xiàn)TEAD1的靶基因包括EGFR、AQP4、CDH4、TNC等多個候選靶基因。
作者利用不同亞型人GBM腫瘤樣本，通過ChIP-PCR對TEAD1的候選靶基因進行驗證。進一步結(jié)合TEAD1KO相比于對照的異種移植樣本中靶基因表達水平，EGFR、AQP4、CDH4在TEAD1KO樣本中表達下調(diào)，因此，TEAD1可能是通過結(jié)合靶基因EGFR、AQP4、CDH4調(diào)控其表達進而參與GBM遷移。
TEAD1調(diào)控靶基因參與遷移的機制
TEAD1KO異種移植樣本中EGFR的表達水平低于對照樣本，且TEAD1KO細胞系中EGFR表達相比于正常對照細胞系顯著下調(diào)，TEAD1過表達后EGFR表達有回升。對EGFR下游信號元件的表達水平的檢測發(fā)現(xiàn)，pERK在TEAD1KO細胞中下調(diào)，而pAKT則不同。TEAD1KO細胞經(jīng)過較長時間的培養(yǎng)后，EGFR表達恢復(fù)，而遷移仍受影響。因此，TEAD1直接且短暫地調(diào)控EGFR。
在對照和TEAD1KO細胞中過表達AQP4后，細胞的遷移能力提高了~ 50%，說明AQP4在GBM遷移中發(fā)揮了一定作用。且過表達TEAD1后不僅促進細胞的遷移，同時也上調(diào)了AQP4的內(nèi)源性表達。因此，TEAD1和其下游靶基因AQP4的表達在促進原發(fā)性GBM細胞的遷移中存在直接的機制聯(lián)系。
小結(jié)
作者通過ATAC-seq繪制了膠質(zhì)母細胞瘤干細胞（GSC）和神經(jīng)干細胞（NSPC）的全基因組染色質(zhì)開放區(qū)域圖譜，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)了在腫瘤細胞遷移中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子TEAD1，并通過細胞和異種移植模型水平上的TEAD1的敲除與過表達的體內(nèi)外功能驗證實驗，驗證了TEAD1促進遷移的功能性作用。
作者通過ATAC-seq和轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)篩選出來TEAD1的候選靶基因，并進一步利用ChIP-PCR，驗證了與TEAD1結(jié)合的靶基因–AQP4、EGFR和CDH4。TEAD1敲除使AQP4下調(diào)，TEAD1過表達可恢復(fù)AQP4的表達，而TEAD1和AQP4過表達均可修復(fù)TEAD1KO細胞的遷移缺陷，說明TEAD1作用于靶基因AQP4，調(diào)控其表達，進而參與GBM遷移的直接調(diào)控機制。
【文獻】
Tome-Garcia J, Erfani P, Nudelman G, et al. Analysis of chromatin accessibility uncovers TEAD1 as a regulator of migration in human glioblastoma[J]. Nature Communications, 2018, 9(1).
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