目前Hi-C?技術(shù)主要的應(yīng)用方向是輔助基因組組裝和染色質(zhì)互作。輔助基因組組裝：在已有二代或三代組裝的Draft genome序列和已知染色體數(shù)目的前提下，利用Hi-C測(cè)序數(shù)據(jù)將Draft genome序列進(jìn)行染色體群組的劃分，并確定各序列在染色體上的順序和方向，使基因組組裝組裝水平提升到染色體水平。染色質(zhì)互作：利用Hi-C技術(shù)揭示基因組的一般結(jié)構(gòu)特征，包括從隔室（A/B Compartments）到拓?fù)湎嚓P(guān)結(jié)構(gòu)域（TAD）,最后再到環(huán)（loop）的染色質(zhì)層級(jí)結(jié)構(gòu)；還可以與ATAC-seq、ChIP-seq、DNase-seq和RNA-seq等數(shù)據(jù)進(jìn)行多組學(xué)分析揭示基因組三維結(jié)構(gòu)與表觀遺傳修飾、基因密度和轉(zhuǎn)錄活性之間的關(guān)系。
說(shuō)到Hi-C輔助基因組組裝，百邁客還真是碩果累累呢！2018年就有三篇Nature Genetics和一篇Giga Science見(jiàn)刊，2019年才過(guò)去短短兩個(gè)多月，就已經(jīng)有2篇Molecular Plant見(jiàn)刊了，這成果真是可喜可賀??！
下面就聽小編娓娓道來(lái)吧~~
百邁客成功案例一：二倍體亞洲棉Hi-C輔助基因組組裝
英文題目：Sequencing of 243 diploid cotton accessions based on an updated A genome identifies the genetic basis of key agronomic traits.
中文題目：以更新的亞洲棉A基因組為基礎(chǔ)的243份二倍體棉花的重要農(nóng)藝性狀的研究
發(fā)表期刊：Nature Genetics
發(fā)表時(shí)間：2018年5月
合作單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所
研究方法：基因組、遺傳進(jìn)化和全基因組關(guān)聯(lián)分析等
研究背景
材料選擇
基因組測(cè)序材料：二倍體G. arboreum栽培品種cultivar Shixiya1（SXY1）；
自然群體材料選擇：243份棉花，包含230份亞洲棉G. arboretum和13份草棉G. herbaceum?[243份棉花選自國(guó)家種質(zhì)基因庫(kù)（中國(guó)安陽(yáng)），種植在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所（ICR，CAAS）的溫室中]，插入片段長(zhǎng)度500 bp；測(cè)序深度6X；
遺傳群體材料選擇：親本（GA0146和GA0149），測(cè)序深度20X；2個(gè)混池（F2群體，有絨型和無(wú)絨型各20個(gè)子代），測(cè)序深度30X；
主要研究結(jié)果
1、亞洲棉基因組組裝更新
利用三代測(cè)序儀PacBio平臺(tái)共獲得142.54Gb的原始數(shù)據(jù)，組裝1.71Gb亞洲棉基因組，Contig N50=1.1 Mb，最長(zhǎng)的Contig為12.37 Mb。利用Hi-C技術(shù)獲得超過(guò)20×的reads，將組裝的1573Mb的數(shù)據(jù)定位到13條染色體上，與已經(jīng)發(fā)表的基因組相比，當(dāng)Hi-C數(shù)據(jù)比對(duì)到更新的基因組后，對(duì)角線外的不一致性明顯減少（見(jiàn)圖1a和b）。
圖1，Hi-C數(shù)據(jù)在兩版亞洲棉基因組上的比對(duì)
注：a. Hi-C數(shù)據(jù)與亞洲棉原基因組比對(duì)；b. Hi-C數(shù)據(jù)與亞洲棉更新基因組比對(duì)
2、二倍體棉花群體遺傳進(jìn)化分析
共計(jì)選擇了243份二倍體棉花材料：230份亞洲棉G. arboreum?(A2)?和13份草棉G. herbaceum?(A1)，來(lái)自于中國(guó)南部(SC)，長(zhǎng)江(YZR)和黃河（YER）。以雷蒙德氏棉（G. raimondii）為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，G. herbaceum（草棉）和G. arboretum（亞洲棉）聚類成2個(gè)獨(dú)立的群（見(jiàn)圖2a和b）。G. arboretum（亞洲棉）進(jìn)一步又分為SC，YZR和YER三個(gè)群，顯示了地理分布模式的差異，進(jìn)而利用PCA分析支持這一結(jié)果（見(jiàn)圖2c）。
圖2 二倍體棉花的群體分層分析
注：a，243份二倍體棉花系統(tǒng)發(fā)育樹；b，243份二倍體棉花的群體結(jié)構(gòu)分析c，PCA主成分分析（中國(guó)亞洲棉的PCA分析；亞洲棉和草棉的PCA分析）
3、選擇性清除分析與GWAS分析
人工選擇在農(nóng)作物的馴化和遷徙的過(guò)程中具有重要的作用。群體結(jié)構(gòu)分析顯示當(dāng)K=4時(shí)，YER與SC和YZR明顯不同（圖2b，K=4）。通過(guò)兩兩群體間的選擇性清除分析（FST）鑒定出了分別覆蓋到59，53和51個(gè)顯著遺傳分化的區(qū)域。SC和YZR之間的21個(gè)分化的區(qū)域（約43.5 Mb?含有915個(gè)基因）在群體SC和YER之間是保守的（圖3a）。對(duì)來(lái)自不同環(huán)境下的11個(gè)重要性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，在98個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的信號(hào)中，其中25信號(hào)個(gè)來(lái)自基因區(qū)（外顯子或內(nèi)含子區(qū)），包含與形態(tài)性狀相關(guān)的8個(gè)信號(hào)區(qū)，與產(chǎn)量性狀相關(guān)的6個(gè)信號(hào)區(qū)，與油籽性狀相關(guān)的3個(gè)信號(hào)區(qū)；剩余73個(gè)信號(hào)來(lái)自非編碼區(qū)。大部分農(nóng)藝性狀的GWAS關(guān)聯(lián)信號(hào)中顯示地理差異，如分支數(shù)，開花期，鈴重和抗病性這些性狀定位在保守的基因區(qū)（圖4b）。
參考文獻(xiàn)：Du X, Huang G, He S, et al. Resequencing of 243 diploid cotton accessions based on an updated A genome identifies the genetic basis of key agronomic traits[J]. Nature genetics, 2018, 50(6): 796.
百邁客成功案例二：異源四倍體陸地棉和海島棉Hi-C輔助基因組組裝
英文題目：Reference genome sequences of two cultivated allotetraploid cottons?Gossypium hirsutum?and?Gossypium barbadense.
中文題目：兩個(gè)異源四倍體陸地棉和海島棉基因組破譯
發(fā)表期刊：Nature Genetics
發(fā)表時(shí)間：2018年12月
合作單位：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室
研究方法：基因組、比較基因組分析、遺傳圖譜構(gòu)建及QTL定位等
研究背景
棉花是世界上最大的天然紡織纖維來(lái)源，每年纖維產(chǎn)量的90％以上來(lái)自異源四倍體棉花（G. hirsutum和G. barbadense），它起源于大約1-2百萬(wàn)年前的異源多樣化事件，隨后是數(shù)千年的不對(duì)稱亞基因組選擇。陸地棉（G. hirsutum）由于其高產(chǎn)而在全世界種植。G. barbadense以其卓越的纖維質(zhì)量而受贊譽(yù)。為了培育產(chǎn)生纖維更長(zhǎng)，更細(xì)和更強(qiáng)韌的陸地棉（G. hirsutum）品種，一種合理有效的方法是將海島棉（G. barbadense）的優(yōu)良纖維性狀引入陸地棉。基因組學(xué)啟動(dòng)的育種策略需要對(duì)基因組組織進(jìn)行詳細(xì)而有力的理解。
材料選擇
測(cè)序策略：PacBio RS II、BioNano和Illumina HiSeq
分析軟件：
基因組組裝：Canu (version 1.3)?，BLASR (version 1.3.1)?，BWA (version 0.7.10-r789)?，Pilon(version 1.22)?；光學(xué)圖譜糾錯(cuò)：核酸內(nèi)切酶Nt.BssSI23，AutoDetect，IrysSolve；Hi-C染色體掛載：核酸內(nèi)切酶HindIII，BWA（version 0.7.10-r789），LACHESIS，HiC-Pro；基因組完整性評(píng)估：BUSCO評(píng)估；TE注釋：PASTEClassifier (version 1.0)；RepeatMasker (version 4.0.6)；基因預(yù)測(cè)和注釋：Genscan，Augustus (version 2.4)，GlimmerHMM (version 3.0.4)，GeneID (version 1.4)和SNAP (version 2006-07-28)；GeMoMa (version 1.3.1)；假基因組預(yù)測(cè)：GenBlastA (version 1.0.4)，GeneWise (version 2.4.1)；
著絲粒區(qū)域鑒定：blastn，SPSS software (version 17.0)?；基因組共線性分析：MUMmer (version 3.23)，GATK(version 3.1.1)，Samtools(version 0.1.19)?，MCScanX package；結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)：MUMmer3 (version 3.23)；二倍體棉重測(cè)序SNPs鑒定：Trimmomatic (version 0.32)，BWA；包含168個(gè)個(gè)體的CSSLs群體SNPs鑒定：BWA，GATK和Samtools；CSSLs群體QTLs定位與表達(dá)分析：QTL IciMapping (version 4.0)?；TopHat2 (version 2.0.13)?；Cufflinks (version 2.2.1)；STRUCTURE (version 2.3)?；TASSEL software (version 5.0)?；
主要研究結(jié)果
1、陸地棉Gossypium hirsutum和海島棉Gossypium barbadense基因組組裝及注釋
???本研究利用PacBio RSII、BioNano和Hi-C技術(shù)組裝出了高質(zhì)量的異源四倍體陸地棉G. hirsutum?acc. TM-1和海島棉G. barbadense?acc. 3-79基因組，最終組裝出26條染色體。在陸地棉和海島棉中分別預(yù)測(cè)到70,199和71,297個(gè)基因，PacBio數(shù)據(jù)分析顯示，在全基因組范圍內(nèi)陸地棉6mA甲基化占所有腺嘌呤的0.21%，海島棉占0.22%。且6mA甲基化修飾在每條染色體上是均勻分布的，而5mC修飾在染色體臂中分布較少（見(jiàn)圖1）。
圖1 陸地棉和海島棉染色體特征（含表觀遺傳標(biāo)記）
?2、陸地棉和海島棉染色體結(jié)構(gòu)變異分析
高質(zhì)量的參考基因組使研究人員直接通過(guò)比較基因組就能鑒定大的結(jié)構(gòu)變異成為可能。發(fā)現(xiàn)有170.2 Mb的基因組序列被鑒定為G. hirsutum和G. barbadense之間的倒位，包括120.4 Mb的At亞基因組和49.8 Mb的Dt在A06染色體中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)大的倒位變異，包括3個(gè)染色體臂內(nèi)倒位（in1, in3 and in4）和1個(gè)染色體臂間倒位（in2），通過(guò)Hi-C數(shù)據(jù)在斷點(diǎn)周圍離散的染色質(zhì)相互作用（圖2a），突出了Hi-C技術(shù)識(shí)別大規(guī)模染色體重排的優(yōu)勢(shì)。光學(xué)圖（BioNano optical maps）譜數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了這些反轉(zhuǎn)斷裂位點(diǎn)（圖2b）。
圖2，陸地棉和海島棉A06染色體倒位鑒定
注：a，Hi-C互作熱圖；b，光學(xué)圖譜鑒定
3、漸滲系的構(gòu)建及QTLs定位
由陸地棉Emian22作為受體親本，海島棉3-79作為供體親本構(gòu)建包含168個(gè)個(gè)體的CSSLs群體，旨在引入有利的變異，如纖維質(zhì)量。QTL定位分析，共鑒定到5個(gè)性狀的13個(gè)QTLs位點(diǎn)，其中控制纖維長(zhǎng)度位點(diǎn)2個(gè)，控制纖維強(qiáng)度位點(diǎn)4個(gè)，馬克隆值位點(diǎn)2個(gè)，纖維伸長(zhǎng)率位點(diǎn)2個(gè)，纖維均勻度位點(diǎn)3個(gè)（圖3）。在這些QTLs位點(diǎn)中，9個(gè)位點(diǎn)之前未被鑒定出，通過(guò)檢驗(yàn)13個(gè)QTLs中的基因表達(dá)水平，研究人員檢測(cè)到了235個(gè)在纖維發(fā)育過(guò)程中高度表達(dá)的基因，同時(shí)還整合了基因組變異數(shù)據(jù)來(lái)預(yù)測(cè)候選基因，而這些基因值得進(jìn)一步進(jìn)行精細(xì)定位以確認(rèn)對(duì)這些性狀具有重要影響的基因。
圖4，QTL定位結(jié)果展示
注：a，陸地棉纖維質(zhì)量相關(guān)QTLs分布（紅框）；b，纖維長(zhǎng)度相關(guān)QTL定位；c，纖維伸長(zhǎng)率相關(guān)QTL定位
參考文獻(xiàn)：Wang M, Tu L, Yuan D, et al. Reference genome sequences of two cultivated allotetraploid cottons, Gossypium hirsutum and Gossypium barbadense[J]. Nature genetics, 2019, 51(2): 224.
英文題目：Allele-defined genome of the autopolyploid?sugarcane Saccharum spontaneum L.
中文題目：同源多倍體（Saccharum spontaneum L.）基因組等位基因鑒定
發(fā)表期刊：Nature Genetics
發(fā)表時(shí)間：2018年10月
合作單位：福建農(nóng)林大學(xué)基因組與生物技術(shù)研究中心
研究方法：基因組、比較基因組、群體遺傳進(jìn)化等
研究背景
栽培甘蔗（Saccharum?spp., Poaceae）相比其它主要作物與眾不同，因?yàn)樗嵌啾扼w種間雜種，具有極其復(fù)雜的基因組。目前甘蔗是世界上收獲量最大的第一作物和第五價(jià)值作物（FAO, 2012），甘蔗種植在90多個(gè)國(guó)家的約2600萬(wàn)公頃土地上，每年收獲18.3億公噸，總產(chǎn)值接近570億美元，提供80％的糖和40％的乙醇，作為主要的糖和生物燃料原料作物。雖然現(xiàn)代甘蔗栽培種的高含糖量來(lái)源于栽培種“S. officinarum”，但是它們的耐寒性，抗病性和再生能力更多的來(lái)自于與含糖量低的親本“S. spontaneum”的回交中。Saccharum officinarum品種（2n= 8x=80），在莖中積累蔗糖達(dá)到干重的50％，但是易受生物和非生物脅迫的影響。自然狀態(tài)記錄下染色體數(shù)目最少的S. spontaneum種質(zhì)（2n = 5x =?40）已經(jīng)不存在了，然而，由另一種八倍體SES208單倍化形成的S.spontaneum“AP85-441”（1n = 4x = 32）為甘蔗染色體的原型的組裝提供了基礎(chǔ)。本研究闡釋了最重要，復(fù)雜基因組的基因組作物S. spontaneum遺傳藍(lán)圖和進(jìn)化歷史。
材料選擇
S. spontaneum?AP85-441用于基因組測(cè)序；64份世界種質(zhì)資源庫(kù)材料進(jìn)行重測(cè)序；
測(cè)序策略：IlluminaHiSeq 2500和PacbioRSII
分析軟件：
基因組組裝：BAC文庫(kù)測(cè)序數(shù)據(jù)初步組裝（組裝軟件：ALLPATH-LG,SPAdes和SOAPdenovo2，保留組裝結(jié)果）；PacBio測(cè)序數(shù)據(jù)糾錯(cuò)組裝（CANUv1.5）；Hi-C染色體分群（ALLHIC）。
基因注釋：重復(fù)序列預(yù)測(cè)（RepeatModeler），TE轉(zhuǎn)座子序列鑒定（RepeatMaskerversion 4.05；TEclassversion 2.1.3），串聯(lián)重復(fù)序列分析（TRFpackageversion 4.07）；基因注釋（MAKER，JBrowse，Trinity，PASA，SNAP，GENEMARK，AUGUSTUS等）；注釋完整性評(píng)估（BUSCOversion 3）；
等位基因變異及優(yōu)勢(shì)表達(dá)分析：單倍體基因組構(gòu)建（nucmer，MUMmerpackage，Assemblytics）；等位基因鑒定（MCScanX，GMAP）；等位基因變異分析（nucmer，Assemblytics）；等位基因的優(yōu)勢(shì)表達(dá)（Trimmomatic，HiSAT2)。
重測(cè)序群體結(jié)構(gòu)分析：序列比對(duì)與變異檢測(cè)（Bowtie2，SAMtools，BWA，GATK，SnpEffv3.6c)；基因組遺傳多樣性評(píng)估（π，Tajima’sD）；PCA分析（VCFtools，PLINK）；系統(tǒng)發(fā)育分析（ML trees，PHYLIP package）；群體結(jié)構(gòu)分析（Admixture，STRUCTURE）；基因組重排區(qū)遺傳多樣性與不同多倍體種質(zhì)的基因組遺傳多樣性分析（π，SNP density，Tajima’sD）。
主要研究結(jié)果
1、基因組測(cè)序組裝
本研究中利用Illumina、PacBio和Hi-C技術(shù)，加之本研究團(tuán)隊(duì)研發(fā)的算法ALLHIC成功的將甘蔗基因組組裝到染色體水平，最終組裝出32條染色體，錨定了2.9 Gb基因組，涵蓋了97%的基因含量。進(jìn)一步利用998,370 SNPs的高密度遺傳圖譜來(lái)驗(yàn)證Hi-C組裝的結(jié)果，在兩種方法中，89%的contigs的順序是一致的。32條染色體中包含了8個(gè)同源組群和4組單倍型A，B，C和D（見(jiàn)圖1）。
圖1?S. spontaneum?AP85-441染色體與高粱染色體的比對(duì)
2、基礎(chǔ)染色體數(shù)目的減少
AP85-441基因組的組裝顯示了S. spontaneum的染色體數(shù)目從10降到8，而這與頻繁復(fù)制的古復(fù)制染色體對(duì)相關(guān)，通過(guò)與高粱的聚類比對(duì)，發(fā)現(xiàn)高粱祖先5號(hào)染色體和8號(hào)染色體同源物經(jīng)歷了染色體裂變（見(jiàn)圖2）。SbChr05（A12）的祖先染色體斷裂分為兩個(gè)主要部分，即C5S（A12S）和C5L（A12L），分別轉(zhuǎn)移到SbChr06（A2）和SbChr07（A5）的祖先染色體；SbChr8（A11）的祖先染色體斷裂為兩個(gè)主要的部分，即C8S（A11S）和C8L（A11L），分別轉(zhuǎn)移到SbChr09（A6）和SbChr02（A7 + A9）的祖先染色體中。SbChr8和SsChr5之間及SbChr5和SsChr7之間近乎同源的短片段是在高粱與甘蔗分化前，高粱SSA形成于13.4 MYA同源基因的殘留物，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，S5中較小的SSA區(qū)域和S8中SSA的較大區(qū)域在重排的AP85-441基因組中也是保守的。
圖2 禾本科染色體數(shù)進(jìn)化（高粱n = 10到甘蔗n = 8）
3、S. spontaneum的起源與遺傳多樣性分析
研究中對(duì)世界種質(zhì)資源庫(kù)的64份S. spontaneum材料進(jìn)行重測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其核苷酸多態(tài)性（π）[0.00021±0.000002 ]遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其它克隆繁殖的作物，如馬鈴薯，木薯，葡萄和柑。通過(guò)PCA主成分分析及群體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)64份材料分為3個(gè)群，這些群體也受到自然和地理起源推斷的64份種質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的支持（見(jiàn)圖3），group1來(lái)源于菲律賓，印度尼西亞和巴布亞新幾內(nèi)亞；group2和group3來(lái)源于印度，巴基斯坦和伊朗?；蚪M倍性在三組中差異很大（從6x-16x）。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，表明不同的倍性可能是從祖先獨(dú)立進(jìn)化而來(lái)的。
圖3 64份甘蔗的群體結(jié)構(gòu)與進(jìn)化關(guān)系分析
參考文獻(xiàn)：Zhang J, Zhang X, Tang H, et al. Allele-defined genome of the autopolyploid sugarcane Saccharum spontaneum L[J]. Nature genetics, 2018, 50(11): 1565.
百邁客成功案例四：異源四倍體野生花生Hi-C輔助基因組組裝
英文題目：Genome of an allotetraploid wild peanut?Arachis monticola: a de novo assemble.
中文題目：異源四倍體野生花生（Arachis monticola）基因組組裝
發(fā)表期刊：Giga Science
發(fā)表時(shí)間：2018年6月
合作單位：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
研究方法：基因組
研究背景
花生作為我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是提供重要的蛋白和油料的基礎(chǔ)。作為豆科的重要分支之一，花生屬一共包括30個(gè)二倍體品種，1個(gè)異源四倍體野生花生(A.monticola)和1個(gè)異源四倍體栽培花生(A.hypogaea)(2n = 4x = 40)。作為栽培花生農(nóng)藝性狀改良的重要野生資源供體，野生四倍體花生的基因組也一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。成功破譯四倍體野生花生的基因組有助于科學(xué)家和育種專家對(duì)A.hypogaea起源及馴化過(guò)程的理解。
材料選擇
野生四倍體花生A.monticola；
測(cè)序策略：Illumina X-ten、PacbioRSII和Bionano
分析軟件：
基因組組裝：Canu v1.5，WTDBG，Pilon（v1.22），LoRDEC v0.5，F(xiàn)alcon v0.7，quickmerge v0.2，Allpath-LG v1.4，IrysView v2.5.1等；Hi-C染色體掛載：HiC-Pro，LACHESIS，Pbjerlly2，GapCloser，Pilon；基因組質(zhì)量評(píng)估：BUSCO pipeline v3.0.2?等。
主要研究結(jié)果
在這項(xiàng)研究中，研究人員以野生四倍體花生A.monticola為研究材料，進(jìn)行測(cè)序得到36X SMRT subreads + 76X HiC data + 210X Bionano Irys data + 50XIllumina reads的測(cè)序數(shù)據(jù)，整合多種組裝工具的優(yōu)勢(shì)，最終獲得了參考基因組水平的高質(zhì)量組裝結(jié)果。又利用BioNano和Hi-C等方法對(duì)基因組進(jìn)行區(qū)分最終A.monticola得到的subgenome與祖先A基因組A.duranensis、祖先B基因組A.ipaensis之間的比較。并利用Hi-C數(shù)據(jù)對(duì)獲得的基因組進(jìn)行準(zhǔn)確性評(píng)估（見(jiàn)圖1）。
圖1 四倍體野生花生及兩個(gè)二倍體祖先熱圖評(píng)估
參考文獻(xiàn)：Yin D, Ji C, Ma X, et al. Genome of an allotetraploid wild peanut Arachis monticola: a de novo assembly[J]. GigaScience, 2018, 7(6): giy066.
百邁客成功案例五：雜草稻Hi-C輔助基因組組裝
英文題目：Population Genomic Analysis and De novo Assembly Reveal the Origin of Weedy Rice as an Evolutionary Game.
中文題目：群體基因組分析結(jié)合從頭組裝揭示雜草稻作為進(jìn)化演繹的起源
發(fā)表期刊：Molecular Plant
發(fā)表時(shí)間：2019年1月
合作單位：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
研究方法：基因組、比較基因組、群體遺傳進(jìn)化
研究背景
材料選擇
測(cè)序策略：Illumina Hiseq和PacBio
分析軟件：
303份水稻樣本的SLAF-seq結(jié)果SNP鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建：SOAP，MEGA 7.0；遺傳多樣性分析：BioPerl；QTL定位：利用親本W(wǎng)R04-6和Qishanzhan構(gòu)建F8RIL群體，包含168個(gè)子代，通過(guò)SLAF-seq技術(shù)HighMap軟件構(gòu)建遺傳圖譜和QTL定位；群體進(jìn)化推演分析：DIYABC v. 2.0.3
基因組組裝：Canu，WTDBG，Pilon（v1.22），bwa；Hi-C染色體掛載：bwa，LACHESIS，Pbjerlly2；重復(fù)注釋：LTR-FINDER v1.05，MITE-Hunter，Repeat Scout v1.0.5，PILER-DF v2.4，PASTEClassifier，RepeatMasker v4.0.6；蛋白編碼基因預(yù)測(cè)及評(píng)估：Genscan，Augustus v2.4，GlimmerHMM v3.0.4，GeneID v1.4，SNAP（version 2006-07-28），GeMoMa v1.3.1，PASA v2.0.2，EVM v1.1.1；非編碼RNA預(yù)測(cè)：tRNAscan-SE v1.3.1；假基因預(yù)測(cè)：GenBlastA v1.0.4，GeneWise v2.4.1；基因功能和motif注釋：BLAST v2.2.31，BLAST2GO，InterProScan；結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)：MUMmer4；共線性分析：MCScanX；選擇壓力分析：PAML v4；
主要研究結(jié)果
本研究利用來(lái)自中國(guó)和日本的48份WRAH種系，43份與WRAH共存的溫帶粳稻品種（Japonica-C），26份中國(guó)溫帶粳稻品種（Japonica-L），四個(gè)典型的栽培稻亞群（12tropical?japonica，145?indica/xian,，11?aus和?3?aromatic），15份來(lái)自中國(guó)南方中緯度雜草稻（WRSC）以及已經(jīng)發(fā)表了全基因組SNP信息的30份野生祖先種，基于SLAF-seq共檢測(cè)到122,777個(gè)高質(zhì)量SNP，叫做122k-SNP，用于系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建（見(jiàn)圖1）。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，WRAH在系統(tǒng)發(fā)育上不同于Japonica-C，并且與溫帶粳稻Japonica-L群體形成了明確分群；WRSC種質(zhì)與秈稻種質(zhì)劃分到一個(gè)亞群。
圖1 系統(tǒng)發(fā)育樹分析
2、基因組測(cè)序、組裝及注釋
本研究基于單分子實(shí)時(shí)測(cè)序（SMRT）、高通量NGS和染色質(zhì)構(gòu)象捕獲（Hi-C）技術(shù)組裝了高質(zhì)量的亞洲高緯度雜草稻W(wǎng)R04-6基因組。最終組裝出染色體水平的高質(zhì)量基因組，包含12條染色體，大小為373.93Gb，contigN50位6.09Mb。最后，去除重復(fù)序列后通過(guò)從頭預(yù)測(cè)、同源預(yù)測(cè)和RNA-seq分析共獲得41,385個(gè)基因，有96.32%的基因在NR，KOG,，GO，KEGG，TrEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)中得到了注釋（見(jiàn)圖3）。
圖3 Hi-C輔助基因組組裝熱圖
圖4 雜草稻基因組分布圖
3、比較基因組分析
利用OrthoMCL軟件檢測(cè)WR04-6、R498、Nipponbare和W1943（O. rufipogon）間核心的、非必須的和共有的基因家族。在WR04-6中鑒定到了909個(gè)擴(kuò)張的基因家族，并且通過(guò)通路分析顯示，這些基因在光合作用和呼吸作用中顯著富集（p<0.01），例如氧化磷酸化、光合作用和核糖體的KEGG途徑，考慮其可以作為遺傳改良的信號(hào)。以O. barthii作為外群構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示W(wǎng)R04-6與粳稻祖先的分化時(shí)間估計(jì)在3,706ya（1,235ya-6,326ya），見(jiàn)圖4。
圖4 以O(shè). barthii作為外群構(gòu)建的最大似然樹
參考文獻(xiàn)：Sun J, Ma D, Tang L, et al. Population Genomic Analysis and De novo Assembly Reveal the Origin of Weedy Rice as an Evolutionary Game[J]. Molecular plant, 2019.
英文題目：A Chromosome-Scale Genome Assembly of Paper Mulberry (Broussonetia papyrifera) Reveals the Genetic Basis of Its Forage and Papermaking Usage.
中文題目：染色體水平的基因組揭示構(gòu)樹飼用和造紙的遺傳基礎(chǔ)
發(fā)表期刊：Molecular Plant
發(fā)表時(shí)間：2019年2月
合作單位：中國(guó)科學(xué)院植物研究所北方資源植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室
研究方法：基因組、比較基因組等
研究背景
構(gòu)樹（Broussonetia papyrifera，2n=2x=26）屬于桑科（Moraceae）構(gòu)屬（Broussonetia）多年生喬木，是我國(guó)鄉(xiāng)土樹種和先鋒植物，有悠久的歷史和文化，因?yàn)椴虃愑盟旒埗澜缏劽?。?gòu)樹的樹皮和樹干是造紙的優(yōu)質(zhì)原料，樹葉還可以作為蛋白飼料，其根、莖、葉、果實(shí)及種子均可入藥，富含黃酮類化合物；還是尾礦處理、生態(tài)綠化的理想樹種。然而，有關(guān)構(gòu)樹的研究主要集中于造紙、藥理藥化、養(yǎng)殖以及生態(tài)綠化等應(yīng)用方面，基礎(chǔ)生物學(xué)的研究很少。因此，構(gòu)樹栽培改良的第一步是獲得其遺傳背景，以便能更好地掌握其特有特征的生物學(xué)機(jī)制。
材料選擇
生長(zhǎng)5年的雌性構(gòu)樹用于基因組測(cè)序；基因組測(cè)序的雌性構(gòu)樹與未知雄性構(gòu)樹雜交，獲得包含120個(gè)F1個(gè)體的CP群體用于構(gòu)建遺傳圖譜輔助基因組組裝。
測(cè)序策略：Illumina Hiseq和PacBio
分析軟件：
基因組組裝注釋：基因組組裝：?ALLPATHS-LG，SSPACE，GapCloser，BioNano Genomics?，RefAligner，LoRDEC，Pbjelly，MAPS，ALLMAPS；Hi-C輔助基因組組裝：Hi-C-Pro，LACHESIS；基因組注釋：RepeatMasker (version open-4.0.5)，PILER (version 1.0)，RepeatScout (version 1.0.5)，LTR-finder，MITE，PASTEClassifer，PASA，AUGUSTUS（vertion 3.0.3），SNAP，GlimmerHMM，GeneID，Genescan (version 1.1.0)，），Genewise (version 2.2.0），TopHat2 (version 2.0.7)，Cufflinks (version 2.2.1)，GeneMarkS-T (version 5.1)，?Genewise；基因功能注釋，InterProScan (version 5)，Hmmscan (HMMER, version 3.0)，BLAST2GO (version 2.5)，BLASTP，Trembl，tRNAscan-SE (version 1.3.1)，Infernal cmscan (version 1.1.1)。
比較基因組分析：直系同源基因鑒定：?OrthoMCL (version 2.0)；系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建與分化時(shí)間估算：?MUSCLE、Gblocks (version 0.91b)和RaxML（version 8），MCMCTREE評(píng)估分化時(shí)間；基因家族擴(kuò)張和收縮分析：CAFE（vertion 3.1）；染色體共線性分析、4DTV檢測(cè)及Ks值計(jì)算：MCscan。
主要研究結(jié)果
1、基因組組裝與注釋
本研究使用Illumina HiSeq和PacBio Sequel測(cè)序平臺(tái)，用Hi-C、光學(xué)（BioNano Irys）和遺傳圖譜輔助，進(jìn)行雌性構(gòu)樹的基因組組裝。獲得染色體水平的高質(zhì)量構(gòu)樹基因組，其大小為386.93Mb，scaffold N50是29.48Mb，有99.25%（357.56Mb）的基因組被錨定在13條染色體上，Hi-C熱圖評(píng)估（見(jiàn)圖1）。一共預(yù)測(cè)了30,512個(gè)基因，98.09%與已知基因同源并且得到了功能上的注釋。
圖1 熱圖驗(yàn)證Hi-C輔助染色體組裝
??圖2 構(gòu)樹染色體分布圖
2、構(gòu)樹的基因組進(jìn)化
利用14個(gè)物種（無(wú)油樟、亞麻、毛楊、棉花、擬南芥、黃瓜、苜蓿、桑樹、構(gòu)樹、桃樹、葡萄、番茄、毛竹和玉米）的單拷貝直系同源基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)構(gòu)樹與桑樹在同一分支，在大約3100萬(wàn)年前與桑樹分開，與桃子的分化時(shí)間在大約7800萬(wàn)年前（見(jiàn)圖3），該結(jié)果被4DTv的分析結(jié)果所證實(shí)，通過(guò)Ks分析進(jìn)一步得到證實(shí)。
圖3 14個(gè)物種的系統(tǒng)發(fā)育樹
根據(jù)已報(bào)道的雙子葉植物祖先和譜系特異性WGD，本研究推測(cè)，古六倍化始祖的21條染色體至少經(jīng)歷了11次大的染色體融和（cfus）和2次染色體裂變后產(chǎn)生了?？浦虚g狀態(tài)的12條始祖染色體（見(jiàn)圖4）。桑科的始祖染色體的數(shù)目與葫蘆科和楊柳科是相似的，但是與薔薇科（n = 9）、豆科（n = 6）、錦葵科（n = 16）和茄科（n = 16）是不同的。進(jìn)化推演分析表明，構(gòu)樹的染色體是從桑科的12條始祖染色體經(jīng)27次融合和28次裂變重構(gòu)的，說(shuō)明構(gòu)樹基因組在進(jìn)化過(guò)程中至少經(jīng)歷了68次的染色體融合和裂變。
圖4 構(gòu)樹和其他6種植物基因組重構(gòu)的進(jìn)化推演
3、比較基因組分析
在構(gòu)樹基因組中共發(fā)現(xiàn)15,254個(gè)基因家族，與桑樹分化之后，有431個(gè)基因家族擴(kuò)張，230個(gè)基因家族收縮，表明在適應(yīng)進(jìn)化過(guò)程中，構(gòu)樹中更多的基因家族經(jīng)歷了擴(kuò)張而不是收縮。另外，與苜蓿、毛楊和甜橙相比，轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生明顯收縮（58個(gè)家族共1,342個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，占蛋白編碼基因的4.4%）。肌動(dòng)蛋白在植物的生長(zhǎng)和發(fā)育的很多層面扮演著重要的角色，在酵母和很多動(dòng)物中，肌動(dòng)蛋白僅被一個(gè)單基因編碼。在構(gòu)樹中僅發(fā)現(xiàn)4個(gè)肌動(dòng)蛋白，少于藻類、小立碗蘚和無(wú)油樟。
參考文獻(xiàn)：Peng X, Liu H, Chen P, et al. A Chromosome-Scale Genome Assembly of Paper Mulberry (Broussonetia papyrifera) Provides New Insights into Its Forage and Papermaking Usage[J].?Molecular plant, 2019.
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