圖1 開心果基因組進(jìn)化

2.?開心果應(yīng)激適應(yīng)相關(guān)的擴(kuò)張基因家族

為了揭示開心果表型（如耐鹽性）的遺傳基礎(chǔ)，利用OrthoMCL通過識(shí)別不同植物之間獨(dú)特和共同的基因家族來研究基因家族的進(jìn)化。開心果與擬南芥、柑橘、雷蒙德氏棉、葡萄相比有9735個(gè)共有基因家族，而含有1381個(gè)基因的707個(gè)開心果有特基因家族。對(duì)這些基因進(jìn)行GO與KEGG富集分析，并都發(fā)現(xiàn)了許多與“防御反應(yīng)”有關(guān)的基因，其中包括許多包含NB-ARC domain和NBS-LRR domain的基因。這種基因以植物抗病性著稱，對(duì)開心果的防御反應(yīng)具有相當(dāng)重要的意義。

接下來，作者研究了開心果基因家族的擴(kuò)張和收縮（圖1c）。由于很難從基因家族規(guī)模的收縮或與未在該參考基因組中成功組裝的基因有關(guān)，這里只分析了擴(kuò)展的基因家族。對(duì)擴(kuò)展基因家族的基因富集分析發(fā)現(xiàn)，它們在代謝類別中豐富，如萜類、黃酮類、倍半萜類和生物堿的生物合成?；蚣易宓臄U(kuò)展發(fā)生在長期進(jìn)化之后，并推動(dòng)了黃連木屬和柑橘屬之間的進(jìn)化差異，而不是開心果從野外馴化的非常短期的進(jìn)化。因此，我們認(rèn)為上述基因的擴(kuò)展可能與野生黃連木中有機(jī)化合物的代謝有關(guān)。野生黃連木的植物化學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)了許多植物化學(xué)物質(zhì)，如生物堿、黃酮、香豆素、甾醇、單寧、萜類和倍半萜類。

此外，豐富的術(shù)語“氧化還原過程”包含許多細(xì)胞色素P450基因，這些基因編碼參與多種功能復(fù)雜代謝途徑的蛋白質(zhì)，并在多個(gè)過程中發(fā)揮重要作用，特別是在應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮作用。在187個(gè)細(xì)胞色素P450基因中，我們發(fā)現(xiàn)許多可能具有耐鹽功能。例如，透水性研究發(fā)現(xiàn)，CYP94家族基因表達(dá)水平的升高可減輕水稻的茉莉酸反應(yīng)，增強(qiáng)水稻的耐鹽性。在開心果的這些擴(kuò)張基因家族中，有14個(gè)CYP94基因。大豆中，CYP82A3參與茉莉酸和乙烯信號(hào)通路，增強(qiáng)對(duì)鹽堿和干旱的抗性，開心果擴(kuò)張基因家族中有20個(gè)CYP82基因成員。毛果楊CYP714A3的異位表達(dá)增強(qiáng)了水稻的耐鹽性，開心果擴(kuò)張基因家族中有10個(gè)CYP714A基因。因此，一些細(xì)胞色素P450基因可能與開心果的耐鹽性有關(guān)。

3.?RNA-seq揭示了開心果鹽適應(yīng)的遺傳機(jī)制

進(jìn)一步研究開心果的耐鹽性潛在遺傳機(jī)制，研究者進(jìn)行了鹽度實(shí)驗(yàn)。開心果砧木（P.vera?L.cv.Ohadi）的葉和根在正常條件和鹽度條件下進(jìn)行RNA測序。使用Tophat-Cufflinks-Cuffdiff?pipeline，在鹽水條件下處理的植物與對(duì)照之間表現(xiàn)出差異表達(dá)，鑒定214和461蛋白質(zhì)編碼基因分別在葉和根組織中（ncontrol = 3, nsalinity = 3, corrected P < 0.05,）。基因富集分析發(fā)現(xiàn)許多差異表達(dá)基因（31個(gè)基因）參與到“氧化還原進(jìn)程”中（圖2a，b）。像比較基因組分析一樣，該類別中的15個(gè)基因是細(xì)胞色素P450基因，特別是CYP74A（即AOS），其編碼細(xì)胞色素P450 CYP74基因家族的一個(gè)成員，其起到丙二烯氧化物合酶（AOS）的作用。這種酶催化茉莉酸酯合成中的第一步[即茉莉酸（JA）]。AOS中每千堿基外顯子的表達(dá)片段（FPKM）值在葉片中從對(duì)照中的近0增加到鹽水條件下的2163.75，在根中從對(duì)照中的1.87增加到鹽水處理的87.74。研究者還發(fā)現(xiàn)了7個(gè)差異表達(dá)的基因(ChiC, TT4, ILL6, MYB108, MYB6, PRB1, and TIFY5A)被富集到“茉莉酸反應(yīng)”中。以前的研究表明，干旱和高鹽度導(dǎo)致水稻葉片和根部JA含量增加。鹽度處理可以增加濕地物種鳶尾（Iris hexagona）中的內(nèi)源JA水平。茉莉酸酯激活植物對(duì)生物脅迫（即病原體攻擊）和非生物脅迫（即鹽）的反應(yīng)。在此，用鹽水處理增加了在葉和根中參與茉莉酸反應(yīng)的這些基因的表達(dá)水平（圖2c）。這些基因的表達(dá)增加（例如，AOS作為酶催化茉莉酸酯合成中的第一步）應(yīng)該增加茉莉酮酸酯的合成，因此，它們很可能被開心果用于應(yīng)對(duì)鹽脅迫。

差異表達(dá)的基因富集到“幾丁質(zhì)結(jié)合”，其中四種基因編碼幾丁質(zhì)酶(CHIB, EP3, ChiC, AT2G43590)。植物幾丁質(zhì)酶涉及多種生物系統(tǒng)。植物中的一些幾丁質(zhì)酶是針對(duì)環(huán)境脅迫（如高鹽濃度，寒冷和干旱）而表達(dá)的，并且可以通過植物激素如乙烯，茉莉酸和水楊酸來上調(diào)。例如，基因ChiC編碼V類幾丁質(zhì)酶，其表達(dá)可由茉莉酸和擬南芥鹽度引起的脅迫來誘導(dǎo)。研究者的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，編碼幾丁質(zhì)酶的基因和參與JA生物合成途徑的基因可能有助于開心果適應(yīng)鹽水環(huán)境。

?圖2 鹽處理下開心果的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

4.?不同野生種間混和

為了研究開心果的種群歷史和適應(yīng)性進(jìn)化，研究者對(duì)107個(gè)開心果基因組進(jìn)行重測序，包括93個(gè)品種和14個(gè)野生開心果，平均測序深度為6-8X。作者還重新測序了來自不同近緣種的35個(gè)基因組，包括P.mutica，P.khinjuk，P.integerrima和P. palaestina。用stringent GATK pipeline，發(fā)現(xiàn)14.77百萬個(gè)單基因變異位點(diǎn)，其中2.42百萬個(gè)在基因區(qū)。使用鄰近法和最大似然法的系統(tǒng)發(fā)育分析清楚地分離了5種不同的種群，即?P.vera, P.mutica, P. khinjuk, P. integerrima, and P. palaestina。通過TreeMix程序在一些物種之間檢測到漸滲的信號(hào)，這表明雜交可能在自然界中的不同近親之間發(fā)生，并且與植物中被發(fā)現(xiàn)的普遍雜交一致。然而，從其他開心果物種到馴化的開心果沒有檢測到漸滲，這種現(xiàn)象來源于野生的P. vera（圖3）。

?圖3 不同野生種間的基因漸滲

5.?開心果兩步馴化歷程

基于重測序數(shù)據(jù)，研究人員推測了這些物種的有效群體大小的變化，并發(fā)現(xiàn)在 Pleistocene期間發(fā)生了瓶頸事件，且在 ~200 kyr前，有效群體大小增加。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示馴化和野生開心果之間的分離（圖4a）。利用δaδi推算野生和馴化開心果的分化時(shí)間在 ~8000年前，這與早在公元前6750年就表明開心果種子是一種常見的食物這一考古記錄相似。為了深入了解開心果種質(zhì)之間的遺傳關(guān)系，研究人員進(jìn)行了兩項(xiàng)經(jīng)典分析：群體結(jié)構(gòu)和主成分分析（圖4b，c）。這些分析清晰的顯示栽培種質(zhì)分為兩個(gè)群。栽培種Group I的LD最高，栽培種Group II和野生開心果的LD衰減值相近。Group II包括 Qazvini，Italiaei和Badami

Zarand在內(nèi)的5種類型的個(gè)體，且這些種質(zhì)被記錄為古代具有種子的材料（圖4d）。與系統(tǒng)發(fā)育樹一致，這三個(gè)品種含有較高比例的野生血統(tǒng)（圖4e）,這些結(jié)果支持了其兩步馴化的過程，初步馴化，然后通過作物育種進(jìn)行改良。

圖4 野生和馴化開心果的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

6.?開心果馴化的遺傳機(jī)制

群體核苷酸多態(tài)性θπ分析揭示了馴化型種質(zhì)的核苷酸多態(tài)性低于野生型種質(zhì)，通過分析發(fā)現(xiàn)，栽培種質(zhì)中基因組上的一些區(qū)域的多態(tài)性降低，這些區(qū)域可能含有受到人工選擇的基因。此外，研究人員鑒定了栽培型和野生型樣品分化水平增加的區(qū)域。在馴化和野生的開心果之間，在基因組上約有9.2 Mb的區(qū)域被鑒定為具有高水平的群體分化。栽培種間遺傳多樣性降低，且超過95%的閾值。遺傳多樣性減少的區(qū)域和群體分化增強(qiáng)的區(qū)域在馴化或育種過程中經(jīng)歷了選擇性清除。共計(jì)有665個(gè)基因定位在該區(qū)域。研究人員定位了受正向選擇的候選基因，其可能與馴化過程中重要的表型進(jìn)化相關(guān)。在開心果馴化的過程中，其樹形大小經(jīng)歷了人工選擇（圖5a）。研究人員發(fā)現(xiàn)了基因SAUR55（圖5b），編碼生長素應(yīng)激蛋白，在植物的生長過程中發(fā)揮重要的作用，其在開心果的人工選擇下進(jìn)化而來。除此之外，基于也和根的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，馴化種與野生種相比，基因SAUR55表現(xiàn)出了顯著增加的表達(dá)水平（圖5c）。這些結(jié)果與在其它作物（如水稻和小麥）中生長素應(yīng)激性基因的選擇性清除的研究結(jié)果一致，并揭示了在作物馴化期間類似特征性狀的人工選擇。果實(shí)重量是作物馴化和育種期間最重要的特征之一，包括開心果。在栽培種中，品種成分與果實(shí)重量呈正相關(guān)（圖4e）。這支持了一個(gè)結(jié)論，在開心果中，果實(shí)重量的人工選擇發(fā)生在馴化與人工選擇期間。研究人員指出，基因CYCD7-1在人工選擇的進(jìn)化下，野生種和馴化的栽培種之間具有高度的群體分化特征。該基因編碼D型細(xì)胞周期蛋白，控制細(xì)胞分裂及種子發(fā)育過程中的生長率。CYCD7-1基因的過表達(dá)包括在胚胎和胚乳中的細(xì)胞增殖和細(xì)胞增大，其在擬南芥中導(dǎo)致種子過度生長。基因CYCD7-1在花粉和早期發(fā)育中顯示特殊表達(dá)，但在葉和根中沒有表達(dá)。因此，有希望在未來的實(shí)驗(yàn)中比較野生型和馴化型開心果在花粉和早起發(fā)育時(shí)期CYCD7-1基因的表達(dá)，研究人員提出在CYCD7-1基因上進(jìn)行的人工選擇可能會(huì)改變開心果的重量。

?圖5 開心果果樹大小的人工選擇

結(jié)論

本研究為開心果的局部適應(yīng)和馴化提供了遺傳學(xué)基礎(chǔ)。黃連木屬物種基因組序列有助于未來的研究，以了解沙漠作物農(nóng)藝和環(huán)境相關(guān)性狀的遺傳基礎(chǔ)。

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