研究背景

小球藻為單細(xì)胞可食用綠藻，能夠合成蝦青素和油脂；蝦青素是一種結(jié)構(gòu)獨特的酮式類胡蘿卜素，是自然界已知最強的抗氧化劑。含油脂高的藻類可作為生物質(zhì)能源。

實驗設(shè)計

材料選擇：小球藻 取種子細(xì)胞培養(yǎng)到生長對數(shù)期的后期，分成3組，用于做不同處理；
處理方式：對照組T1：不做處理；
高光處理組T2：光照90μmol光子?2 s?1，6h；
葡萄糖誘導(dǎo)組T3：30g/L葡萄糖處理， 6h；
測序方法：Hiseq2500，4G/樣；

技術(shù)路線：

研究結(jié)果

1. 蝦青素和脂類定量分析

對照和葡萄糖處理組相比，葡萄糖誘導(dǎo)下的小球藻中，蝦青素含量96h后增加了30倍，而處理組中96h后只增加了8倍。脂類和TFA含量也有類似的情況。對照組中這三種成分增加較少可能是培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分限制的原因，在氮饑餓的情況下，導(dǎo)致在相同器官中蝦青素和脂肪酸產(chǎn)量增加。

2. RNA-SEQ分析

三種不同的處理構(gòu)建三個文庫，測序獲得clean data 10.63G，Trinty組裝獲得32931個unigenes。52.8%的unigenes在NR,Swiss-Prot,KEGG,GO,COG獲得注釋。

3. 差異表達(dá)基因分析

計算RPKM，做差異表達(dá)分析。T1與T2差異表達(dá)基因數(shù)為580，T1與T2差異表達(dá)基因數(shù)為1489。在光處理和葡萄糖處理兩種情況下，差異基因功能注釋表明這些基因都是與翻譯、核糖體、蛋白過程、脅迫和碳固定相關(guān)的。在光處理下，卟啉和葉綠素代謝、光刺激應(yīng)答是被富集的。在葡萄糖處理情況想，葡萄糖、能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化、脂肪合成等都是被富集的；而這些基因在光合作用、核糖體、蛋白運輸通路中是減少的。在碳源充足的情況下，生長和能量存儲基因是上調(diào)表達(dá)的，而光合作用是下調(diào)表達(dá)的。

4. RT-PCR驗證

作者選了10個與蝦青素和三酰甘油合成有關(guān)的unigenes進(jìn)行了RT-PCR驗證，其中9個基因的表達(dá)趨勢與RNA-seq結(jié)果一致。只有PDS兩種結(jié)果不同，可能是RNA-seq結(jié)果不準(zhǔn)確，因為前人的研究成果中，葡萄糖是上調(diào)PDS表達(dá)的，與本文中RT-PCR結(jié)果一致。

5. 蝦青素合成

在轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)MEP通路中的8個基因都被鑒定到，但是在MVA通路中只有2個基因被檢測到，其中HMG表達(dá)不顯著，ACAT表達(dá)量下降。這些結(jié)果表明小球藻中蝦青素的合成通路中IPP和DMAPP是MEP通路合成的。其中，發(fā)現(xiàn)一個可能編碼β-胡蘿卜素激酶（BKT2）與數(shù)據(jù)庫中的BKT1比對率僅為56%。功能分析發(fā)現(xiàn)BKT2可以轉(zhuǎn)化β-胡蘿卜素成為角黃素。下圖為蝦青素合成通路圖。在葡萄糖處理情況下，與蝦青素合成相關(guān)的6個基因上調(diào)差異表達(dá)。在小球藻中，葡萄糖誘導(dǎo)蝦青素的合成，伴隨著BKT1，CHYb,PDS在24h內(nèi)上調(diào)表達(dá)。為研究轉(zhuǎn)錄組水平基因表達(dá)量與產(chǎn)物含量的關(guān)系，分析了5個限速基因的表達(dá)量，這些基因在葡萄糖處理72h或92h表達(dá)量達(dá)到最高，相應(yīng)的，蝦青素的積累量也在96h達(dá)到穩(wěn)定水平。

6. 三酰甘油的合成

藻類和植物中脂肪酸的生物合成主要在葉綠體中進(jìn)行。乙酰-CoA作為合成的起始物質(zhì)。基于轉(zhuǎn)錄組測序，小球藻質(zhì)體中脂肪酸合成基因被鑒定到。在葡萄糖處理情況下，這些基因大都表達(dá)量上調(diào)。另外這次測序結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)幾個基因?qū)?yīng)的不同轉(zhuǎn)錄本。由于BC和SAD是脂肪酸合成的限速酶基因，做了進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)BC和SAD表達(dá)量從6h到72h表達(dá)量持續(xù)上升，對應(yīng)的三酰甘油含量從24h到96h持續(xù)增加。

三酰甘油（TAG）合成有兩條通路：乙酰-CoA依賴的通路和乙酰-CoA不依賴的通路；轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中兩條通路中的基因都被鑒定到。

文章亮點

1：材料選擇+處理條件；
小球藻關(guān)注的成分具有重要的經(jīng)濟價值，處理條件是可以促進(jìn)經(jīng)濟成分積累，研究更加有利用價值；

2：實驗數(shù)據(jù)+前人結(jié)果，深入驗證；
測序結(jié)果中重點關(guān)注關(guān)鍵成分（蝦青素和TAG）合成通路中的每一個基因，對其進(jìn)行差異分析，并做不同時期的表達(dá)量分析；解釋清楚在處理情況下，物質(zhì)合成與基因表達(dá)的關(guān)系。針對本文的研究結(jié)果與前人研究成果比較分析。