研究背景

由于砷污染對(duì)世界范圍內(nèi)的食品安全和人類(lèi)健康造成的威脅，稻田砷污染越來(lái)越受到人們的關(guān)注。間歇性洪水和周期排水對(duì)稻田砷的影響顯著。特別是稻田的洪澇條件會(huì)導(dǎo)致砷As(III)的釋放，進(jìn)而被水稻吸收。膳食大米已經(jīng)成為人體砷的主要來(lái)源，因此，了解缺氧水稻土壤中砷的釋放機(jī)制對(duì)砷污染稻田的修復(fù)意義重大。

生物炭是有機(jī)物在低氧條件下熱解產(chǎn)生的固體富碳物，近年來(lái)，因其在農(nóng)業(yè)和環(huán)境方面的效益而被廣泛關(guān)注。生物炭可以提高土壤固碳能力，改善土壤質(zhì)量，提高作物產(chǎn)量。生物炭的pH值、吸附能力、表面積、陽(yáng)離子交換能力和微孔體積較高，能夠去除土壤中的重金屬污染物。此外，生物炭也可以通過(guò)加強(qiáng)電子轉(zhuǎn)移來(lái)促進(jìn)金屬反應(yīng)。研究表明，生物炭修正引起砷(As)大量釋放的原因，主要是由微生物群落的轉(zhuǎn)移和鐵Fe(III)還原菌豐度的增加導(dǎo)致的。

在稻田中，砷的釋放與氧化鐵的氧化還原反應(yīng)密切相關(guān)，金屬還原菌能夠通過(guò)金屬呼吸作用控制金屬污染物的轉(zhuǎn)移。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，排水后的稻田As(V)轉(zhuǎn)移率較低，這是因?yàn)镕e(III)氧化物可以高度吸附As(V)，限制了砷的轉(zhuǎn)移，然而洪澇爆發(fā)時(shí)，微生物介導(dǎo)的Fe(III)還原作用會(huì)將吸附的As(V)釋放到水中，同時(shí)，吸附和釋放的As(V)能夠被As(V)還原菌異化還原為As(III)。有些異化As(V)呼吸菌也是鐵還原菌（如Geobacter和Shewanella），它們可以同時(shí)釋放Fe(II)和As(III)。研究表明，生物炭修正后的砷污染水稻土壤中，梭菌（Clostridium）、芽孢桿菌（Bacillus）和喜熱菌屬（Caloramator）占主導(dǎo)地位，地桿菌（Geobacter）、

厭氧粘細(xì)菌（Anaeromyxobacter）、Desulfosporosinus和土地桿菌（Pedobacter）豐度也升高。目前，生物炭修飾對(duì)水稻土壤砷轉(zhuǎn)移的影響，以及對(duì)砷污染水稻土壤微生物群落的轉(zhuǎn)錄活性和功能的影響仍不清楚。16s rRNA測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組定量被認(rèn)為是描述活躍菌群和微生物活性的更好指標(biāo)。

研究目的

本研究以受砷污染的水稻土壤為材料，采用生物炭進(jìn)行厭氧微生物試驗(yàn)。其目的在于：1. 通過(guò)監(jiān)測(cè)生物炭修正和無(wú)生物炭的微環(huán)境中砷和鐵形態(tài)的動(dòng)態(tài)變化，評(píng)價(jià)生物炭修正對(duì)缺氧水稻土壤中的砷生物地球化學(xué)的潛在影響；2. 通過(guò)16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)，調(diào)查砷轉(zhuǎn)化過(guò)程中的活性菌群多樣性；3. 利用RT-qPCR定量分析主要的砷相關(guān)細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄水平及潛在作用，進(jìn)一步分析砷轉(zhuǎn)移與轉(zhuǎn)錄水平之間的相關(guān)性。

材料與方法

1. 土壤、生物炭和微環(huán)境

土壤樣品取自于汕頭市蓮花山鎢礦下游的砷污染稻田，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后低溫保存；生物炭制備于產(chǎn)自馬來(lái)西亞的油棕纖維；：將水稻土壤與30℃去離子水共孵育3周，激活土壤微生物，消耗原生電子受體，模擬稻田的淹水環(huán)境；厭氧微環(huán)境試驗(yàn)：120mL血清瓶，70mL培養(yǎng)液（30 mM PIPES緩沖液，pH 7.3），7g水稻土壤（濕重），氮?dú)飧綦x，1 mL/L微量元素溶液，1 mL/L維生素溶液，10 mM 乳酸，30℃靜置過(guò)夜；設(shè)置3個(gè)分組：3%（w/w）生物炭修正的水稻土壤、無(wú)生物炭修正的水稻土壤（對(duì)照組）、無(wú)菌土壤（對(duì)照組）（γ射線輻射處理）；每個(gè)采樣周期（第0、1、2、5、10和20天）采集3個(gè)微環(huán)境樣品，提取總RNA，檢測(cè)砷和鐵的形態(tài)變化。

2. 砷和鐵的形態(tài)變化

高效液相色譜結(jié)合氫化物發(fā)生原子熒光的方法(HPLC-HG-AFS)。

3. RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

MoBio試劑盒提取土壤樣本的總RNA，Prime Script RT試劑盒（Takara）反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

4. 活性微生物的菌群結(jié)構(gòu)

16s rRNA V4（515R/806F），illumina PE250，QIIME 1.8.0，RDP數(shù)據(jù)庫(kù)。

5. 金屬還原相關(guān)菌的檢測(cè)

使用Geo494F/Geo825R、Chis150f/ClostIr、FAc12-66F/FAc12-432R和She120F/She220R這4對(duì)引物，分別對(duì)地桿菌（geobacter）、希瓦氏菌（Shewanella）、梭菌（clostridium）和厭氧粘細(xì)菌（Anaeromyxobacter）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR），分析這4種金屬還原菌的豐度。

結(jié)果與分析

1. 砷和鐵的釋放

從圖1a和1b來(lái)看，生物炭修正的水稻缺氧土壤中，F(xiàn)e(III)的還原與As(V)的解吸或釋放均被促進(jìn)，As(III)的濃度與Fe(II)的濃度密切相關(guān)，F(xiàn)e(III)和As(V)的降低是同時(shí)發(fā)生的；從圖1c來(lái)看，在整個(gè)孵育期間，無(wú)菌土壤中均未觀察到鐵和砷的明顯釋放，表明鐵和砷的降低是由微生物導(dǎo)致的。

?圖1. 不同孵育階段，生物炭修正（a）、無(wú)生物炭修正（b）和無(wú)菌（c）水稻土壤的釋放性砷As(III)/As(V)和鐵Fe(II)/Fe(III)的濃度。

2. 活性微生物的菌群結(jié)構(gòu)

α-多樣性分析結(jié)果表明，水稻土壤的生物炭修正組、無(wú)生物炭修正和無(wú)菌組的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和物種數(shù)目均無(wú)顯著性的差異，表明生物炭修正對(duì)水稻土壤微生物菌群多樣性的影響微乎其微。在門(mén)水平，生物炭修正組和無(wú)生物炭修正組中厚壁菌門(mén)（firmicutes）的豐度差異可能與生物炭有關(guān)（圖2）；在屬水平，生物炭修正提高了水稻土壤中的地桿菌（Geobacter）、厭氧粘細(xì)菌（Anaeromyxobacter）和梭菌（clostridium）的豐度（圖3），這3種菌均與砷、鐵的還原有關(guān)。

圖2. 生物炭修正（a）、無(wú)生物炭修正（b）水稻土壤的“門(mén)”和“綱”水平活性微生物的相對(duì)豐度。

圖3. 生物炭修正（a）、無(wú)生物炭修正（b）水稻土壤的“屬”水平活性微生物的相對(duì)豐度差異比較（“*”號(hào)表示p＜0.05。

3. 金屬還原菌的轉(zhuǎn)錄水平活性

在生物炭修正組中，地桿菌（geobacter）相對(duì)轉(zhuǎn)錄豐度顯著高于對(duì)照組（無(wú)生物炭修正組）（圖4a），表明生物炭顯著提高了水稻土壤中地桿菌（geobacter）的轉(zhuǎn)錄活性。此外，生物炭對(duì)孵育初期的厭氧粘細(xì)菌（Anaeromyxobacter）和希瓦氏菌（Shewanella）的轉(zhuǎn)錄也有積極影響，然而抑制了對(duì)菌（clostridium）的轉(zhuǎn)錄水平（圖4b-d）。

在生物炭修正組中，地桿菌（geobacter）的轉(zhuǎn)錄水平與砷As(V)的釋放濃度顯著正相關(guān)（Pearson，R=0.98，p＜0.001；Spearman，R=1，p＜0.001），梭菌（clostridium）的轉(zhuǎn)錄水平與鐵Fe（III）的釋放濃度顯著負(fù)相關(guān)（Spearman，R = 0.829 ，P < 0.05）。由此可見(jiàn)，在生物炭修正的水稻土壤中，地桿菌（geobacter）和梭菌（clostridium）可以通過(guò)提高轉(zhuǎn)錄水平快速響應(yīng)砷As(V) 和鐵Fe(III)的釋放。

圖4. 生物炭修正與無(wú)生物炭修正的水稻土壤的（a）：地桿菌（geobacter）；（b）梭菌（clostridium）；（c）厭氧粘細(xì)菌（Anaeromyxobacter）和（d）希瓦氏菌（Shewanella）的相對(duì)轉(zhuǎn)錄豐度。

表1. 地桿菌（Geobacter）、?梭菌（Clostridium）、厭氧粘細(xì)菌（Anaeromyxobacter）和希瓦氏菌（Shewanella）的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平與釋放砷As(V)和鐵Fe(III)的Pearson和Speraman相關(guān)性檢驗(yàn).

研究結(jié)論

本文以砷污染的水稻土為研究對(duì)象，通過(guò)構(gòu)建厭氧微環(huán)境，探究生物炭存在下的砷轉(zhuǎn)移、活性菌群變化及它們的轉(zhuǎn)錄活性水平。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，生物炭可以促進(jìn)微生物對(duì)砷As(V)和鐵Fe(III)的還原，提高土壤溶液中的砷As(III)釋放。提取環(huán)境樣本中的總RNA研究微生物的群落結(jié)構(gòu)，與對(duì)照組相比，生物炭提高了地桿菌（geobacter）、厭氧粘細(xì)菌（Anaeromyxobacter）和梭菌（clostridium）3種與砷、鐵相關(guān)的細(xì)菌。RT-PCR結(jié)果表明，生物炭顯著促進(jìn)了地桿菌（geobacter）的轉(zhuǎn)錄水平。此外，在生物炭修正的微生境中，地桿菌（geobacter）的轉(zhuǎn)錄水平與砷As(V)含量，梭菌（clostridium）的轉(zhuǎn)錄水平與鐵Fe(III)含量均呈顯著的負(fù)相關(guān)性?？傊?，生物炭能夠通過(guò)促進(jìn)金屬還原細(xì)菌的活性提高砷As轉(zhuǎn)移，地桿菌（geobacter）和梭菌（clostridium）分別能降低生物炭中的砷As(V)和鐵Fe(III)含量。

參考文獻(xiàn)：

Qiao?J?T?,?Li?X?M?,?Li?F?B?.?Roles?of?different?active?metal-reducing?bacteria?in?arsenic?release?from?arsenic-contaminated?paddy?soil?amended?with?biochar[J].?Journal?of?Hazardous?Materials,?2017:S0304389417308476.