英文題目：Identifification of epilepsy-associated neuronal subtypes and gene expression underlying epileptogenesis

中文題目：鑒定癲癇相關(guān)的神經(jīng)元亞型和誘發(fā)癲癇的基因表達(dá)

發(fā)表時(shí)間：2020年10月7號(hào)

影響因子：12.121

研究背景

癲癇是一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有自發(fā)性和反復(fù)發(fā)作的特征，其主要發(fā)生在海馬體或大腦皮層區(qū)域。人們對(duì)癲癇的病理生理學(xué)仍然知之甚少。雖然有一些動(dòng)物模型研究顯示某些神經(jīng)元亞型對(duì)癲癇發(fā)作的產(chǎn)生和傳播有一定的促進(jìn)作用，但在人類癲癇患者的相應(yīng)數(shù)據(jù)卻很少。這是由于癲癇發(fā)生過(guò)程中復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)現(xiàn)象。

實(shí)驗(yàn)方法

10x snRNA-seq，Smart-seq2?snRNA-seq，RNA-seq，ISH等

結(jié)論

該項(xiàng)研究揭示了癲癇對(duì)神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄的不同影響—即雖然許多亞型表現(xiàn)出輕微的基因表達(dá)變化，但其對(duì)一些特定的SUB型主要神經(jīng)元和GABA能間神經(jīng)元產(chǎn)生了很大的影響。

結(jié)果

一、癲癇皮質(zhì)中與疾病相關(guān)的神經(jīng)元亞型

為了識(shí)別哪些神經(jīng)元亞型受癲癇影響或?qū)е掳d癇，文章中比較了來(lái)自癲癇性顳皮質(zhì)和非癲癇性顳皮質(zhì)的snRNASeq數(shù)據(jù)，研究結(jié)果表明，在一些位置，例如，皮層上層L2_Cux2_Lamp5和L2-3_Cux2_Frem3，在癲癇和非癲癇的皮層產(chǎn)生的神經(jīng)元之間存在明顯的轉(zhuǎn)錄組轉(zhuǎn)移(圖1a)。此外，盡管癲癇病和非癲癇病樣本中每個(gè)亞型的神經(jīng)元數(shù)量大致相似，但觀察到幾種亞型中已被鑒定的細(xì)胞核數(shù)量顯著減少(圖1b)。在癲癇患者中，L2/3亞型的數(shù)量減少了，當(dāng)對(duì)每種情況下的序列神經(jīng)元總數(shù)進(jìn)行歸一化時(shí)，這種減少更加明顯(圖1c)。對(duì)于中間神經(jīng)元，Pvalb_Sulf1亞型的神經(jīng)元數(shù)量減少較多(圖1c)。

通過(guò)基因表達(dá)相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)癲癇和非癲癇神經(jīng)亞型之間的巨大差異(圖1d)，這可能表明癲癇對(duì)其轉(zhuǎn)錄組有特定的影響。對(duì)于主要神經(jīng)元，L5-6_Fezf2_Tle4_Abo、L5-6_Themis_Ntng2、L2_
Cux2_Lamp5和L2-3_Cux2_Frem3亞型在癲癇和非癲癇皮質(zhì)中轉(zhuǎn)錄組差異大(圖1d)。對(duì)于gaba能間神經(jīng)元，在癲癇發(fā)作的顳葉皮層中，Vip_Cbln1、Sst_Tac1、Pvalb_Sulf1、Pvalb_Nos1和Id2_Lamp5_Nos1的轉(zhuǎn)錄組改變大。同時(shí)也證實(shí)了癲癇相關(guān)DE基因在具有較大轉(zhuǎn)錄組差異的神經(jīng)元亞型中普遍存在(圖1e、f)。

圖1癲癇和非癲癇數(shù)據(jù)集的整合和疾病相關(guān)神經(jīng)元亞型的鑒定

二、共有和亞型特異性癲癇相關(guān)途徑

作者計(jì)算了每種已鑒定亞型GO中DE基因的富集程度，一些神經(jīng)元亞型在癲癇中表現(xiàn)出了大的轉(zhuǎn)錄組改變(>100豐富的GO)，但多數(shù)神經(jīng)元亞型中只有少數(shù)GO，特別是對(duì)于生物過(guò)程(BP)來(lái)說(shuō)，這應(yīng)該與通路的生物學(xué)功能相關(guān)(圖2a)。這些受影響較小的亞型中，大多數(shù)在癲癇細(xì)胞和非癲癇細(xì)胞之間也具有高的基因表達(dá)相關(guān)性(圖1d)，從而證實(shí)癲癇和非癲癇之間轉(zhuǎn)錄組相關(guān)性高的亞型中，癲癇改變的信號(hào)通路也較少。

根據(jù)GO分析，發(fā)現(xiàn)一些Sst亞型、Vip_Cbln1和Id2_Lamp5亞型顯示DO高度富集，如局灶性癲癇(DOID:2234)、癲癇綜合征(DOID:1826)和顳葉癲癇(DOID:3328)。此外，還發(fā)在L3_Cux2_Prss12、L5-6_Fezf2_Lrrk1_Sema3e和L5-6_Fezf2_Tle4_Abo主要神經(jīng)元亞型中富集的與癲癇相關(guān)的DO相同。這表明，與癲癇相關(guān)的DO在不同的神經(jīng)元亞型中富集差異很大，與谷氨酰胺能細(xì)胞相比，在GABAergic和Sst亞型Vip_Cbln1和Id2_Lamp5中，癲癇相關(guān)的DO在GABAergic和Sst亞型Vip_Cbln1和Id2_Lamp5中富集更廣泛，顯示出對(duì)癲癇的特殊易感性。

圖2神經(jīng)元亞型中癲癇相關(guān)通路和轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)移的鑒定

三、癲癇活動(dòng)的信號(hào)通路

谷氨酸受體，尤其是AMPA受體被證明是癲癇發(fā)作的主要驅(qū)動(dòng)力之一，在篩選出缺乏表達(dá)的基因后，尋找富含與奮性相關(guān)轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化的亞型，并從這些GO項(xiàng)中繪制DE基因（圖3a–d）。CKAMP44是貫穿整個(gè)顳葉皮質(zhì)的主要AMPA受體輔助亞基，這一事實(shí)也強(qiáng)調(diào)了CKAMP44上調(diào)的重要性(圖3c, d)。癲癇對(duì)AMPA受體輔助亞基編碼基因的上調(diào)有相當(dāng)普遍的影響。

多種谷氨酸受體亞基和神經(jīng)元活性相關(guān)基因表達(dá)復(fù)雜失調(diào)，其中大部分在癲癇中未見(jiàn)報(bào)道。因此,雖然大多數(shù)的基因編碼谷氨酸受體亞基表達(dá)上調(diào)(GRIA1、GRIA3 GRIA4, GRIK3, GRIK4, GRIK5, GRIN2B, GRIN3A, GRM1, GRM7,和GRM8),但一些是表達(dá)下調(diào)(GRIA2、GRIA3 GRIN2A, GRM5, GRIK1,和GRIK2)(圖3?b, c)。

圖3鑒別可能導(dǎo)致癲癇發(fā)作的皮層神經(jīng)元亞型的信號(hào)通路和基因

癲癇患者皮層谷氨酸介導(dǎo)興奮相關(guān)基因顯著分層上調(diào)或下調(diào)。作者用單分子熒光原位雜交(smFISH)方法標(biāo)記了幾個(gè)高度調(diào)控基因的mRNA。如上所述，在主要神經(jīng)元的亞型中，編碼AMPA輔助亞基的許多基因分層上調(diào)。因此，在一組癲癇和非癲癇樣本的皮質(zhì)切片中標(biāo)記了CKAMP44 mRNA，通過(guò)與Rorb和DAPI共標(biāo)記，并確定了L2/3、L4和L5/6的位置(圖4b)。重要的是，證實(shí)了各層中CKAMP44的表達(dá)顯著上調(diào)(圖4b)。

圖4癲癇患者皮層谷氨酸介導(dǎo)興奮相關(guān)基因的復(fù)雜分層失調(diào)

四、受癲癇影響的基因網(wǎng)絡(luò)

在癲癇樣本中，六個(gè)與癲癇密切相關(guān)的模塊上調(diào)，六個(gè)下調(diào)。另外，在細(xì)胞水平分析中突出的幾個(gè)涉及過(guò)度興奮信號(hào)和癲癇發(fā)作的基因也是一個(gè)或多個(gè)癲癇相關(guān)基因模塊的成員。編碼谷氨酸受體亞基的基因也廣泛存在于癲癇相關(guān)模塊中。這些基因共表達(dá)分析捕獲了主要神經(jīng)元L5-6_Fezf2_Tle4_Abo和L2-3_Cux2亞型中活躍的核心轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)。與癲癇狀態(tài)相關(guān)的基因模塊指向與突觸和離子通道相關(guān)的轉(zhuǎn)錄變化，包括AMPA受體輔助亞基、谷氨酸受體亞基和電壓門(mén)控鈉通道，這些可能與癲癇回路異常高的興奮有關(guān)。同時(shí)觀察到主要神經(jīng)元和GABAergic間神經(jīng)元的受影響的亞型根據(jù)豐富的GO項(xiàng)的相似性聚集在一起(圖5b)。因此，L2-3_Cux2和L5-6_Fezf2亞型與Sst_Tac1和Vip_Cbln1亞型共聚，而L3_Cux2_Prss12亞型與Pvalb_Sulf1亞型共聚，這可能是癲癇轉(zhuǎn)錄組中受影響嚴(yán)重的局部神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)。

圖5綜合分析癲癇易受影響的神經(jīng)元亞型

結(jié)論

總之，該研究通過(guò)單核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（snRNA-seq）發(fā)現(xiàn)癲癇患者的神經(jīng)轉(zhuǎn)錄組發(fā)生了大規(guī)模而復(fù)雜的變化，其中一些亞型表現(xiàn)出了明顯的癲癇驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)異常，而其他亞型則大部分未受影響。癲癇相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組改變可以聚集成包含多個(gè)神經(jīng)元亞型的模塊，這些神經(jīng)元亞型可能是受癲癇影響的不同神經(jīng)元聚集的基礎(chǔ)。未來(lái)需要在小鼠模型和人類組織中進(jìn)行轉(zhuǎn)化研究，以解決哪些已確定的通路導(dǎo)致癲癇的產(chǎn)生和傳播，以及哪些更能代表神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)態(tài)可塑性。

百邁客引進(jìn)10xGenomics單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)，使用Chromium系統(tǒng)采用微流控、油滴包裹和barcode標(biāo)記等技術(shù)實(shí)現(xiàn)一次性分離、高效標(biāo)記捕獲；同時(shí)具有10x 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞ATAC-seq、單細(xì)胞免疫組庫(kù)、全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、空間轉(zhuǎn)錄組，實(shí)現(xiàn)10x平臺(tái)全面優(yōu)質(zhì)服務(wù)；已經(jīng)具有大量單細(xì)胞分離捕獲，極低量RNA反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增建庫(kù)成功經(jīng)驗(yàn)；提供單細(xì)胞分離捕獲、反轉(zhuǎn)錄建庫(kù)、測(cè)序、標(biāo)準(zhǔn)分析和高級(jí)分析全套單細(xì)胞測(cè)序服務(wù)；強(qiáng)大的生信團(tuán)隊(duì)不僅提供基本分析，還提供細(xì)胞分化軌跡分析等多種高級(jí)分析；資深單細(xì)胞技術(shù)人員為您提供專業(yè)的課題方案設(shè)計(jì)，為您量身訂造專屬個(gè)性化分析。

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本次我們給大家?guī)?lái)兩篇利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)助力動(dòng)物細(xì)胞圖譜繪制的高分文章解讀，希望能給老師后續(xù)的研究提供思路。

動(dòng)物細(xì)胞圖譜分析繪制案例：黑腹果蠅

中文標(biāo)題：果蠅細(xì)胞圖譜：成年果蠅的單核轉(zhuǎn)錄組圖譜

英文標(biāo)題：Fly Cell Atlas: A single-nucleus transcriptomic atlas of the adult fruit fly

期刊：Science[IF: 63.714] 2022.3.4

DOI：10.1126/science.abk2432

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)材料：黑腹果蠅

實(shí)驗(yàn)方法：解剖了來(lái)自雌性和雄性黑腹果蠅的12個(gè)組織（觸角、體壁、脂肪體、平衡棒、心臟、腸道、腿、馬氏管、絳色細(xì)胞、喙和下顎須、氣管、翅膀）以及3個(gè)性別特異性組織（雄性生殖腺、睪丸、卵巢）。對(duì)于遍布全身的組織使用特異性GAL4驅(qū)動(dòng)核-GFP蛋白，再用流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)標(biāo)記和收集細(xì)胞核，進(jìn)行單細(xì)胞核snRNA-seq

測(cè)序策略：單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組10x Genomics、Smart-seq2

研究?jī)?nèi)容

黑腹果蠅在生物學(xué)研究方面有著豐富的歷史，以往研究探索了其不同組織中的表達(dá)模式，但缺乏細(xì)胞類型分辨率級(jí)別的數(shù)據(jù)庫(kù)。近年來(lái)單細(xì)胞技術(shù)的進(jìn)步使得同時(shí)對(duì)數(shù)千個(gè)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析成為可能，促進(jìn)了全組織細(xì)胞圖譜的創(chuàng)建。然而，現(xiàn)有scRNA-seq數(shù)據(jù)集來(lái)自不同實(shí)驗(yàn)室，是基于不同遺傳背景，不同分離方法以及不同測(cè)序平臺(tái)產(chǎn)生的，阻礙了跨細(xì)胞和組織的基因表達(dá)的系統(tǒng)性分析。

該研究通過(guò)對(duì)果蠅多組織進(jìn)行單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后，得到了果蠅細(xì)胞圖譜。之后對(duì)15個(gè)組織進(jìn)行詳細(xì)的細(xì)胞注釋，在果蠅頭部，注釋到了81種主要的神經(jīng)細(xì)胞類型，在果蠅的軀體中注釋了最豐富的33種細(xì)胞類型。該圖譜還可用于進(jìn)行相同細(xì)胞的跨組織分析，作者通過(guò)分析血細(xì)胞在整個(gè)組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)了血細(xì)胞中最常見(jiàn)的細(xì)胞類型——漿細(xì)胞，并未在成蟲(chóng)血細(xì)胞中觀察到葉狀血細(xì)胞。通過(guò)對(duì)肌肉細(xì)胞在不同組織類型進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)它們主要在果蠅軀體、體壁和腿部有特定的富集，并發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟肌、骨骼肌、間接飛行肌的分離。

通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子分析，找到了500個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞類型具有高特異性，繪制了每種細(xì)胞類型中特異轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)熱圖。此外，作者還使用SCENIC預(yù)測(cè)了基于共表達(dá)和motif富集的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)對(duì)廣泛細(xì)胞類型或組織的基因進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)了在各種細(xì)胞類型中的常見(jiàn)表達(dá)基因和特定表達(dá)基因。

通過(guò)對(duì)性別依賴的基因表達(dá)和性別特異性組織分析，發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞中的主要性別決定基因doublesex（dsx）的表達(dá)在很大程度上不具有性別特異性，而許多其他基因的表達(dá)具有性別依賴。作者進(jìn)一步對(duì)精母細(xì)胞和精細(xì)胞進(jìn)行軌跡推斷，發(fā)現(xiàn)精母細(xì)胞期被轉(zhuǎn)錄的基因數(shù)量持續(xù)增加，許多強(qiáng)烈上調(diào)的基因在任何其他細(xì)胞類型中都沒(méi)有基本表達(dá)。然而，晚期精母細(xì)胞顯示了來(lái)自許多其他細(xì)胞類型的標(biāo)記基因的表達(dá)。

果蠅細(xì)胞圖譜：成年果蠅的單核轉(zhuǎn)錄組圖譜

動(dòng)物細(xì)胞圖譜分析繪制案例：食蟹猴

中文標(biāo)題：食蟹猴單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和調(diào)控組參考圖譜

英文標(biāo)題：A reference single-cell regulomic and transcriptomic map of cynomolgus monkeys

期刊：Nature comuiations?[IF: 17.694]?2022.07.13

DOI：10.1038/s41467-022-31770-x

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)材料：成年食蟹猴

實(shí)驗(yàn)方法：選取16個(gè)器官（心、肝、脾、肺、腎、胃、結(jié)腸、肌肉、氣管、主動(dòng)脈、脂肪、膀胱、舌頭、乳腺、子宮和睪丸）

測(cè)序策略：10x Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（scRNA-seq）和單細(xì)胞染色質(zhì)開(kāi)放性測(cè)序（scATAC-seq）

研究?jī)?nèi)容

非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物（Non-human primates）在系統(tǒng)發(fā)育上與人類非常接近，在遺傳、器官發(fā)育、生理功能、病理反應(yīng)和生化代謝等諸多方面表現(xiàn)出與人類相似的特征，是生物醫(yī)學(xué)研究和藥物開(kāi)發(fā)的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。其中，最為典型的代表當(dāng)屬食蟹猴。系統(tǒng)評(píng)估食蟹猴等非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型與人類的細(xì)胞組成差異、器官異質(zhì)性和基因表達(dá)時(shí)空特異性等在基礎(chǔ)研究中具有十分重要的價(jià)值。

該研究對(duì)成年食蟹猴的16個(gè)代表性器官進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和單細(xì)胞染色質(zhì)開(kāi)放性測(cè)序，構(gòu)建了食蟹猴多器官的單細(xì)胞多組學(xué)參考圖譜，將25萬(wàn)個(gè)細(xì)胞進(jìn)行 t-SNE降維聚類得到40余種不同的細(xì)胞亞群。

通過(guò)對(duì)該細(xì)胞圖譜進(jìn)行分析，鑒定到了新的細(xì)胞類型。為了解析上皮細(xì)胞異質(zhì)性，作者提取上皮細(xì)胞并進(jìn)行亞群聚類分析。根據(jù)marker基因的獨(dú)特表達(dá)模式，分析鑒定出14個(gè)上皮細(xì)胞簇，包括基底細(xì)胞、分泌細(xì)胞、纖毛細(xì)胞和非纖毛細(xì)胞。纖毛上皮細(xì)胞在各種組織中都占很大比例，為了探索纖毛上皮細(xì)胞亞型的發(fā)育和功能動(dòng)態(tài)，作者選用纖毛上皮細(xì)胞相對(duì)較多的器官，使用Monocle和RNA速度分析對(duì)纖毛上皮細(xì)胞進(jìn)行軌跡分析，觀察到纖毛細(xì)胞從祖細(xì)胞狀態(tài)向成熟狀態(tài)分化的過(guò)程，沿著擬時(shí)間高表達(dá)的基因在與代謝過(guò)程、細(xì)胞對(duì)刺激的反應(yīng)和防御反應(yīng)相關(guān)的基因本體(GO)術(shù)語(yǔ)中順序富集。

使用CellPhoneDB細(xì)胞通訊分析，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞和髓系細(xì)胞之間存在強(qiáng)烈的細(xì)胞間相互作用。通常，細(xì)胞間相互作用的強(qiáng)度和模式是器官特異性的。為了重新繪制調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的分子相互作用，作者在不同器官的特定細(xì)胞亞群中繪制了配體-受體對(duì)，揭示了猴子各種器官細(xì)胞間通信的潛在分子機(jī)制。

結(jié)合表達(dá)譜和染色質(zhì)開(kāi)放性數(shù)據(jù)，作者分析預(yù)測(cè)了控制不同細(xì)胞類型基因表達(dá)模式的關(guān)鍵調(diào)控子。發(fā)現(xiàn)SPIB、POU2F2、SPI1、CEBPD和IRF4是髓系細(xì)胞中的關(guān)鍵調(diào)控子；而FEV具有調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的潛能，該轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與對(duì)免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控。大多數(shù)順式調(diào)控元件(CREs或ATAC峰)來(lái)自啟動(dòng)子、內(nèi)含子或遠(yuǎn)端基因間調(diào)控區(qū)。在scATAC-seq數(shù)據(jù)中預(yù)測(cè)了9種細(xì)胞類型，在RNA簇中發(fā)現(xiàn)了兩種罕見(jiàn)的細(xì)胞類型，單核細(xì)胞和循環(huán)B細(xì)胞，但在ATAC簇中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。總之，本文中的scATAC-seq數(shù)據(jù)為無(wú)偏見(jiàn)地發(fā)現(xiàn)食蟹猴的細(xì)胞類型和調(diào)控DNA元件提供了豐富的資源。

最后，作者進(jìn)行了跨物種比較分析，通過(guò)整合分析器官匹配的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，探討了人、食蟹猴和小鼠三個(gè)物種之間的細(xì)胞組成和基因表達(dá)特異性。猴子和人類在同源基因表達(dá)方面表現(xiàn)出明顯高于其他比較的細(xì)胞類型相似性。其中，免疫細(xì)胞相較于非免疫細(xì)胞，人類和猴子之間的基因表達(dá)具有更高的相似性。間質(zhì)細(xì)胞在人鼠和猴鼠比較中表現(xiàn)出最高的相似性。這些發(fā)現(xiàn)表明，猴子在免疫系統(tǒng)中與人類具有高度相似的轉(zhuǎn)錄程序，因此可能為研究對(duì)癌癥或新冠病毒COVID-19等疾病的免疫反應(yīng)提供理想的模型。

食蟹猴多器官單細(xì)胞多組學(xué)參考圖譜構(gòu)建與分析

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