百邁客單細胞和空間轉(zhuǎn)錄組測序

單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA）是在單細胞水平進行高通量基因表達譜檢測，對復雜細胞群深入分析，表征單個細胞的表達譜，避免單個細胞的異質(zhì)性生物學信息被大量細胞的均質(zhì)化覆蓋。

空間轉(zhuǎn)錄組（ST）是以高空間分辨率解析RNA-seq數(shù)據(jù)的技術，實現(xiàn)解析單個組織切片中的所有mRNA，從而能夠定位和區(qū)分功能基因在特定組織區(qū)域內(nèi)的活躍表達信息，對于癌癥、免疫、腫瘤免疫相互作用，組織微環(huán)境，神經(jīng)和發(fā)育等領域，有著令人期待的應用前景。
單細胞和空間轉(zhuǎn)錄組技術原理對比：

 

英文題目：A single-cell and spatially resolved atlas of human breast cancers

中文題目：人類乳腺癌的單細胞和空間分辨率圖譜

發(fā)表雜志：nature genetics

影響因子：24.36

DOI：10.1038/s41588-021-00911-1

乳腺癌是一個復雜的細胞生態(tài)系統(tǒng)，目前人類對它們細胞組成和組織的了解是有限的。此項研究中作者對人類乳腺癌進行單細胞和空間分辨轉(zhuǎn)錄組學分析，并開發(fā)了一種固有亞型分類的單細胞方法來揭示復發(fā)性腫瘤細胞的異質(zhì)性。利用轉(zhuǎn)錄組和空間轉(zhuǎn)錄組進行免疫分型，最終提供了高分辨率的免疫圖譜和乳腺癌細胞結構的全面轉(zhuǎn)錄圖譜。

研究背景

目前對人類乳腺癌細胞異質(zhì)性和組織結構的理解主要來源于組織學、批量測序、低維假 設研究和實驗模型系統(tǒng)。不同的細胞亞群與腫瘤微環(huán)境(TME)中的細胞以及與疾病狀態(tài)之間的關系仍未明確。單細胞RNA測序（scRNA-scq）則為系統(tǒng)描述腫瘤的細胞景觀提供了顯著的新機會，并為揭示了細胞生物學、疾病病因?qū)W和藥物反應提供了新見解。最近的研究了來自數(shù)百名患者的數(shù)百萬細胞，以探究乳腺癌細胞類型和生態(tài)系統(tǒng)。因此，需要一個更詳細的高分子分辨率的乳腺腫瘤轉(zhuǎn)錄圖譜，進一步界定疾病的分類，識別細胞的異質(zhì)性，從而確定細胞分類。scRNA-seq和stRNA-seq相關數(shù)據(jù)則可以更好的確定TME中的細胞是如何組織成功能單位的。

實驗方法

材料：

(1) 單細胞轉(zhuǎn)錄組：26個腫瘤原發(fā)灶組織，包括11個ER+、5個HER2+和10個TNBC患者

(2) 空間轉(zhuǎn)錄組：6個腫瘤原發(fā)灶組織，包括來自本研究scRNA-seq隊列的2個ER+（CID4535和CID4290）和2個TNBC（CID44971 和 CID4465），以及2個在其它實驗室中處理的TNBC（1142243F 和 1160920F）

方法：單細胞轉(zhuǎn)錄組測序、空間轉(zhuǎn)錄組測序

研究結果

1. 人類乳腺癌的高分辨率細胞圖譜

為了闡明乳腺癌的細胞結構，作者通過scRNA-seq分析了26個原發(fā)腫瘤，包括11個ER+， 5個HER2+和10個TNBCs。共對130246個單細胞數(shù)據(jù)進行了分析注釋（圖la，b）。主要的細胞類型代表了所有腫瘤和臨床亞型（圖lc）。UMAP顯示腫瘤間質(zhì)和免疫細胞聚集在一起。在腫瘤人群中，大量大規(guī)?；蚪M重排被觀察到。這揭示了患者獨特的拷貝數(shù)變化和乳腺癌中常見的變化，如腔癌中chrlq增加和基底樣乳腺癌中chr5q丟失。

2. SCSubtype: scna -seq數(shù)據(jù)的固有亞型

由于無監(jiān)督聚類不能發(fā)現(xiàn)腫瘤間復發(fā)的腫瘤細胞基因表達特征，作者嘗試使用建立的PAM50方法對細胞進行分類，并開發(fā)了一種兼容scRNA -seq的方法來進行固有分子亞型劃分。作者使用了1100個乳腺腫瘤的癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)集和大約2000個固有乳腺癌基因列表，對樣本進行層次聚類。最終確定4組基因，這些基因?qū)⒍x單細胞衍生的分子亞型。作者將這些基因定義為 “SCSubtypc”基因標記。

SCSubtype顯示，20個樣本中有13個樣本的腫瘤細胞低于90%屬于1個分子亞型，而只有1個腫瘤顯示完全同質(zhì)（圖2b） 。在一些管腔和HER2E腫瘤中，SCSubtype預測了少量的基底樣細胞，由免疫組學驗證（圖2c）。其應用進一步證明了低細胞性小葉癌的能力，主要為LumB和LumA細胞的混合物（圖2b），這與臨床IHC結果一致。

3. 復發(fā)性基因模塊驅(qū)動腫瘤細胞異質(zhì)性

接下來作者又以一種無監(jiān)督的方式研究了驅(qū)動腫瘤內(nèi)轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性（ITTH）的生物途徑，對至少50個腫瘤細胞進行整合聚類，生成574個ITTH基因標記。并識別出七個群體，即“基因模塊”（GMs）。基因集富集鑒定出這些GMs共有的和獨特的功能特征（圖2e）。GM4在MKI67、PCNA和CDK1等基因驅(qū)動的細胞周期和增殖標記中具有獨特的富集作用。GM3主要富集干擾素應答、抗原呈遞和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。GM1和GM5表現(xiàn)出雌激素反應途徑的特征，而GM1在缺氧、腫瘤壞死因子α和p53信號轉(zhuǎn)導和細胞凋亡中也表現(xiàn)出富集。
對于每個腫瘤細胞，作者計算了7個GMs的特征

（圖2e）。GM4在MKI67、PCNA和CDK1等基因驅(qū)動的細胞周期和增殖標記中具有獨特的富集作用。GM3主要富集干擾素應答、抗原呈遞和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。GM1和GM5表現(xiàn)出雌激素反應途徑的特征，而GM1在缺氧、腫瘤壞死因子α和p53信號轉(zhuǎn)導和細胞凋亡中也表現(xiàn)出富集。
對于每個腫瘤細胞，作者計算了7個GMs的特征評分，并使用層次聚類來識別細胞相關性。這清楚的將腫瘤細胞進行了分組，減少圖ld-f中所示的巨大腫瘤間變異性。一些模塊與SCSubtype相關聯(lián)，而其他模塊則顯示了更多樣化的子類型關聯(lián)（圖2f，g）。最后，作者使用基于GM的細胞狀態(tài)分配來了解腫瘤細胞的瘤內(nèi)異質(zhì)性。類似于SCSubtype（圖2b），看到了與腫瘤亞型廣泛一致但不受腫瘤亞型限制的細胞異質(zhì)性證據(jù)（圖2h）。SCSubtype和GM分析為腫瘤性ITTH的分類提供了互補的新方法，并進一步證明大多數(shù)腫瘤中癌細胞表現(xiàn)出不同的表型。

4. 乳腺癌的免疫環(huán)境

高分辨率下檢查乳腺腫瘤的免疫微環(huán)境，作者重新聚集免疫細胞，以識別T細胞、固有淋巴細胞、髓樣細胞、B細胞和漿細胞。通過細胞轉(zhuǎn)錄組和表位測序(CITE-seq)對4個樣本進行免疫表型分析，并進行基于錨點的整合，將蛋白表達水平轉(zhuǎn)移到其余病例中，結果顯示與實驗測量值高度相關。

5. 淋巴細胞和先天淋巴樣細胞

作者又在患者中發(fā)現(xiàn)了18個T細胞和先天淋巴細胞簇（圖3a）。在這5個CD8集群中，由3個高表達抑制性檢查點分子包括 LAG3、PDCDI 和 TIGIT和2個低表達 IFNG 和 TNF的CD8 + T細胞組成。另外還發(fā)現(xiàn)了由1型干擾素(IFN-I)信號和增殖驅(qū)動的兩個簇，它們都由CD4+和CD8+ T細胞組成。通過αβ T細胞受體和NK標記的表達，作者還鑒定了自然殺傷細胞(NK)和自然殺傷T (NKT)樣細胞。

在TNBC樣本中，IFITl/c6、LAG3/c8 和MKI67/C11的T細胞比例更高（圖3c）。值得注意的是，在TNBC中LAG3/C8消耗的CD8亞群顯著表達PD-1、LAG3、CD27和CD70配受體，可增強T細胞的細胞毒性（圖4f）。在不同的臨床亞型中，檢查點分子表達的差異更為明顯，包括在非免疫細胞(如CAFs)上。這些數(shù)據(jù)提供了對每種亞型疾病最適合的免疫治療策略的見解。

6. 骨髓細胞

骨髓細胞形成13個簇，可在所有腫瘤中以不同頻率被識別（圖4a）。單核細胞形成三個簇，其中Mono:FCGR3A群體形成了一個小而獨特的簇，以CDI6蛋白高表達為特征（圖4b，c）。作者鑒定了表達CLEC9A或CD1C的傳統(tǒng)樹突狀細胞（cDCs），表達 IRF7和 LAMP3，這在之前的乳腺癌單細胞研究中未見報道。巨噬細胞形成6個簇，其中一個簇具有先前“M1-like”表型相關的特征，還有兩個簇類似于“M2-like”表型，所有這些簇都與之前在乳腺癌中描述的TAMs有一些相似之處。值得注意的是，作者發(fā)現(xiàn)了在傳統(tǒng)的M1/M2分類之外的兩個新的巨噬細胞群體（圖4a-c）。這些細胞與最近報道的脂質(zhì)相關巨噬細胞(LAMs)在肥胖小鼠和人類中擴增的轉(zhuǎn)錄組相似性非常高。同時還觀察到HER2+腫瘤中LAMI:FABP5細胞的比例大幅降低(圖4d)， 這表明獨特的腫瘤基因組學特征或微環(huán)境調(diào)節(jié)LAM1/2的命運。雖然RNA編碼PD-L1和PD-L2在Mac:CXCL10和DCLAMP3髓系群體中高度共表達(圖4f)，但CITE-seq 數(shù)據(jù)的分析顯示，PD-L1和 PD-L2蛋白表達在Mac:CXCL10、LAM1:FABP5、LAM2:AP0E和DC:LAMP3簇中分布更廣(圖4b和圖7g)，突出LAM1/2作為免疫調(diào)節(jié)分子的重要來源。

7. 基質(zhì)亞類類似于不同的分化狀態(tài)

在基質(zhì)室中，作者鑒定了三種主要的細胞類型(圖5a，b)。Monocle2的偽時間軌跡分析揭示了5種CAF狀態(tài)。狀態(tài)1(s1)具有高表達的間充質(zhì)干細胞(MSCs)和炎性樣CAFs (iCAFs)特征。當細胞向分化狀態(tài)s4和s5過渡時，這些標記物的表達減少，這種分化狀態(tài)通過增加ACTA2 (aSMA)、TAGLN、FAP和COL1A1的表達和富集ECM相關通路而類似于肌成纖維細胞樣CAF狀態(tài)。

對于PVL細胞，作者識別出三種狀態(tài)（圖5e）。PVL sl和s2表達與干細胞、未成熟周細胞和粘附分子相關的標志物相關。s2的分支由RGS5、CD248和THY1確定。與基因表達一致，CITE-seq顯示PVL早期s1和s2中細胞表面CD90（THY1）和整合素分子CD49a 、CD49d的富集（圖5i，j）。當細胞轉(zhuǎn)移到PVL s3時，這些標記的表達減少，而PVL s3則富含與收縮相關的基因和平滑肌表型相關的通路（圖5），揭示PVL s3細胞在IHC檢測中一直被誤分類為CAFs。

接下來，作者確定了三種內(nèi)皮狀態(tài)（圖5g）。當細胞分成兩種狀態(tài)時，這些標記物隨著偽時間的推移而減少，這兩種狀態(tài)都伴有內(nèi)皮細胞標記物DLL4的表達升高（圖5h）。內(nèi)皮細胞s2以RGS5和ESM1區(qū)分，而s3表達細胞遷移和血管生成調(diào)節(jié)因子。由于血管的生成是一個動態(tài)過程，涉及內(nèi)皮柄細胞和頂端細胞之間的轉(zhuǎn)換。在臨床亞型和三個正常乳腺組織樣本中鑒定出相似的CAF、PVL和內(nèi)皮細胞狀態(tài)，表明它們可能是在TME中經(jīng)歷重構的固有細胞類型。

8. 對乳腺癌異質(zhì)性進行空間映射

為了深入了解組織細胞類型，作者對6個樣本進行了空間轉(zhuǎn)錄組學分析（圖6a），同時作者還將其與scRNA-seq數(shù)據(jù)進行了匹配分析（圖6b）。在6個病例中，通過立體鏡和病理學識別出癌細胞的位置，然后檢查每個位置的7個GM標記，這揭示了在TNBC病例中 GM3和GM4的預期富集以及在ER +病例中GM1和GM5的預期富集。這揭示了兩個主要的星系團GM1、GM3、GM5和GM6和另一個星系團的GM2和GM4在6個病例中大多是保守的（圖 6d）。有趣的是，GM3和GM4在所有樣本中顯示出強烈的負相關（圖6e-g），表明這些不同的癌癥表型發(fā)生在乳腺癌相互排斥的區(qū)域。

9. 繪制新的異型細胞相互作用

雖然一些研究表明間充質(zhì)細胞在調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用，但基質(zhì)細胞和免疫細胞之間的相互作用尚未在組織中被闡明。作者在6例病患中發(fā)現(xiàn)5例肌成纖維細胞樣CAFs和iCAFs 之間存在中度負相關性（圖7a-c）。CAF定位在7個HER2+乳腺腫瘤的獨立空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是一致的，表明這種關系在不同的臨床亞型中是保守的（圖7a）。與上述iCAFs的免疫調(diào)節(jié)特性一致的是，在兩項研究中，iCAFs均與多個淋巴細胞群體共定位（圖7a,d，c）。在6個樣本中，肌成纖維細胞樣CAFs與CD8+T細胞相關（圖7a），揭示與高TIL浸潤或免疫炎癥表型的浸潤性乳腺癌的功能相關。通過整合信號預測和細胞鄰近性，這些數(shù)據(jù)突出了 CAFs直接調(diào)控免疫細胞的相關候選因子。

之前，作者定義了巨噬細胞狀態(tài)LAM1，LAM2和Mac:CXCL10/c9，它們是具有高表達的免疫調(diào)節(jié)分子。在所有的局部Visium病例中，LAM1和LAM2細胞均存在于浸潤性腫瘤區(qū)域；然而，LAM2也存在于高基質(zhì)細胞、脂肪細胞和淋巴細胞的形態(tài)學區(qū)域。在所有三個亞型的8個腫瘤中，LAM2細胞與CD4+和CD8 + T細胞正相關（圖7a）。多個腫瘤的LAM2細胞和CD4+/CD8+T細胞富集的spots共同表達PD-L1/PD-1和PD-L2/PD-1，表明這些細胞可能具有免疫調(diào)節(jié)的功能相關性。

10. 乳腺腫瘤生態(tài)型與患者生存相關

作者在26個腫瘤中觀察到顯著的變異和細胞頻率的重復模式，并從單細胞數(shù)據(jù)集中估計細胞組分，發(fā)現(xiàn)捕獲的細胞組分和預測的比例之間具有良好的整體相關性，大多數(shù)細胞類型出先顯著相關性。作者還觀察到在匹配bulk-PAM50分類的腫瘤中，聚類顯示9個細胞組成相似的腫瘤簇（“生態(tài)型”）（圖8a-c）。這些生態(tài)型與腫瘤亞型、sc亞型細胞和主要細胞類型的多樣性相關（圖8a）。Ecotype 3（E3）在含有Basal_SC等細胞和基底樣PAM50亞型的腫瘤中富集（圖8a，b）。El、E5、E6、E8和E9主要由管腔細胞組成。E4對與抗腫瘤免疫相關的免疫細胞高度富集（圖8a）。E2 主要由 LumA 和正常樣腫瘤組成（圖8a,b）。

在預后方面，E2腫瘤患者預后較好（圖8d，e）， E3腫瘤患者5年生存率較差（圖8d）， 這與已知的基底樣和高增殖腫瘤的不良預后相一致。E7預后也較差，以HER2E腫瘤為主；E4 也有相當大的比例HER2E和基底樣腫瘤（圖8b），但這些患者的預后明顯好于E7，可能是抗腫瘤免疫細胞浸潤的結果。通過對整合基因組群與生態(tài)型之間的關聯(lián)性進行研究，發(fā)現(xiàn)E3中來自整合基因組群10的癌癥比例很高，5年生存率同樣很低。E7有很高比例的ERBB2擴增和HER2E整合基因組簇5。然而大多數(shù)生態(tài)型與特定的整合基因組簇或PAM50亞型沒有明確的關聯(lián)，這反映了基質(zhì)細胞和免疫細胞在生態(tài)型中的作用。

小結

在此項研究中，作者主要將乳腺腫瘤細胞結構分為三個層次。首先，詳細的細胞分類，包括新的細胞類型和狀態(tài)，以及表征細胞異質(zhì)性的新方法。第二，腫瘤內(nèi)細胞位置和相互作用的空間圖譜，揭示組織內(nèi)腫瘤和宿主細胞表型的協(xié)調(diào)性及細胞之間的空間關系。第三，利用反褶積，作者還觀察了具有相似細胞類型比例和預后相關性的腫瘤組，稱為生態(tài)型，通常由特定的共分離細胞群驅(qū)動。未來的工作將研究組織結構和腫瘤生態(tài)型的分子機制，旨在解釋它們在臨床結果上的差異，并研究腫瘤生態(tài)型是否可以用于個體化治療。